高效液相色谱-蒸发光散射检测测定黄芪中黄芪甲甙的含量
作者:周春玲 鲁静
单位:周春玲(辽宁省药品检验所,辽宁 沈阳 110023);鲁静(中国药品生物制品检定所,北京 100050)
关键词:黄芪;黄芪甲甙;高效液相色谱-蒸发光散射检测
中国中药杂志000314 摘 要:目的:建立测定黄芪中黄芪甲甙含量的新方法。方法:采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定。结果:黄芪甲甙在2.02~10.12 μg与峰面积积分值呈良好的线性(r=0.9997,n=5),平均回收率为100.5%。结论:为控制黄芪中黄芪甲甙的含量提供了新的方法。
Determination of Astragaloside Ⅳ in Radix Astragali by HPLC
with Evaporative Light Scattering Detector
, http://www.100md.com
ZHOU Chun-ling
(Liaoning Provincial Institute for Drug Control,Shenyang 110023,Liaoling,China)
LU Jing
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050,China)
Abstract:Objective:To develop a new method for the determination of astragaloside Ⅳ in Radix Astragali.Method:A HPLC-ELSD method was set up,using Hypersil C18 column (150 mm×4.6 mm),acetonitrile-water(1∶2) as mobile phase with a flow rate of 1.0 ml.min-1.The parameters of drift tube and gas flow rate of the detector were set at 105 ℃ and 2.96 L.min-1 respectively.Result:The calibration curve was linear in the range of 2.02~10.12 μg.The average recovery was 100.5%.Conclusion:The active constituent astragaloside Ⅳ in Radix Astragali can be separated effectively.ELSD detection is appropriate for the determination of constituents with end absorption at low ultra-violet wavelengths.
, 百拇医药
Key words:Radix Astragali;astragaloside Ⅳ;HPLC-ELSD▲
黄芪为重要的益气中药,味甘,性温,有补气固表,利尿,托毒,排脓,敛疮,生肌等功效[1]。我国药典规定以豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪A. membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根供药用。研究表明黄芪甲甙为黄芪中的主要有效成分。迄今为止,测定黄芪甲甙的方法主要有薄层扫描法[2],比色法[3],高效液相色谱法[4]。其中高效液相色谱法灵敏度较高,但因低波长紫外检测时,溶剂背景难以消除。本文试用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定了黄芪中黄芪甲甙的含量。
1 仪器与试剂
, 百拇医药
LC-6A型高效液相色谱泵(日本岛津),ELSD-500检测器(美国Alltech公司),GCK3302全自动空气源(北京惠普),3295积分仪(上海惠普)。
乙腈(色谱纯,天津三达生物医学工程有限公司),其它试剂为分析纯,水为蒸馏水。黄芪甲甙对照品(中国药品生物制品检定所),黄芪药材(中国药品生物制品检定所标本馆)的拉丁学名见表2。
2 色谱条件
色谱柱 Hypersil,5 μm(4.6 mm×150 mm),流动相 乙腈-水(1∶2),室温,流速 1.0 ml.min-1。
3 供试品溶液的制备
本品粗粉约1.5 g,精密称定,置索氏提取器中,加甲醇40 ml冷浸过夜,再加甲醇适量,回流4 h,提取液蒸干,残渣加水10 ml微热使溶解,加水饱和正丁醇振摇提取3次,每次20 ml,合并正丁醇液,用氨试液洗2次,每次20 ml,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣加水5 ml使溶解,放冷,通过D101大孔吸附树脂柱(1.5 cm×12cm),50 ml水洗脱,再40%乙醇30 ml洗脱,继70%乙醇50 ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,甲醇溶解并定容至2 ml量瓶中,滤过,为供试品溶液。对照品及各样品色谱图见图1。
, 百拇医药
图1 对照品及不同种黄芪样品的HPLC色谱图
A.对照品 B.A. mongholicus C.A. membranaceus D.A. floridus E.A. chrysopterus F.A. mongholicus(紫外检测器) a.黄芪甲甙
4 线性关系的考察
精密称定黄芪甲甙对照品10.12 mg,加甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中,精密吸取2,4,6,8,10 μl进样,以进样量(自然对数)为横坐标,峰面积积分值(自然对数)为纵坐标,线性回归方程为Y=1.3943X+12.1417,r=0.9997,进样量在2.02~10.12 μg呈良好的线性关系。
5 精密度实验
精密吸取同一份样品10 μl,重复进样6次,RSD=1.4%。
, 百拇医药
6 重现性实验
同一份样品按制备方法平行制备5份,含量平均值为0.78mg.g-1,RSD=2.0%。
7 回收率实验
精密称定已知含量的样品约0.75 g,精密加入黄芪甲甙对照品溶液20 ml(0.02854mg.ml-1),按供试品制备方法制备样品,测定,结果见表1。
表1 回收率测定结果 样品量
mg
测得量
mg
回收率
, 百拇医药
%
x
%
RSD
%
0.5911
1.1841
103.9
0.5881
1.1512
98.7
0.5885
1.1611
, http://www.100md.com
100.3
100.5
3.23
0.6134
1.1619
96.1
0.6065
1.1964
103.3
注:加入量为0.5708 mg
8 样品测定
5个不同植物种的样品,测定结果见表2。
, http://www.100md.com
表2 样品测定结果 mg.g-1 样品
产地或规格
含量
蒙古黄芪A. mongholicus
山西冲正芪
0.67
蒙古黄芪A. mongholicus
张家口
0.47
蒙古黄芪A. mongholicus
陕西
, 百拇医药
0.28
蒙古黄芪A. mongholicus
山西
0.78
蒙古黄芪A. mongholicus
日本
0.17
膜荚黄芪A. membranaceus
黑龙江
0.56
多花黄芪A. floridus
四川
, http://www.100md.com
0.93
金翼黄芪A. chrysopterus
四川
0.99
9 讨论
9.1 曾试验了甲醇-水(40∶60),四氢呋喃-水(25∶75)及乙腈-水(1∶2)等不同流动相,考察黄芪中各成分的分离情况及检测灵敏度,结果表明,采用乙腈-水(1∶2)为流动相时,分离情况良好。
9.2 按流动相的成分和比例,最初设定漂移管温度为100 ℃,气体流速为2.70 L*min-1通过观察基线噪音和信噪比,确定漂移管温度为105 ℃,气体流速为2.96 L*min-1为最佳的实验条件。
, 百拇医药
9.3 实验中尝试供试品溶液制备不经大孔树脂柱处理,但与经大孔树脂柱处理后得到的供试品比较,峰形及样品含量均不及后者,因此柱纯化是必要的。
9.4 同一植物种不同产地的黄芪中黄芪甲甙含量存在着显著差异,可能与不同生长条件及炮制方法有关。不同植物种皂甙类成分色谱存在着差别(见图1)。
9.5 蒸发光散射检测(ELSD)[5]不受流动相溶剂的干扰,对黄芪甲甙类等具紫外末端吸收的物质,检测效果很好。相同色谱条件用紫外检测器测得图谱见图1中F。
参考文献:
[1]中国药典.1995.271.
[2]鲁 静,王宝琴.黄芪甲甙的薄层扫描法测定.中成药,1992,14(6):34.
[3]陆一心.黄芪甲甙定量方法的研究.中成药,1996,18(2):38.
[4]付铁军,李伯刚,及元乔,等.高效液相色谱法测定黄芪注射液中黄芪甲甙的含量.天然产物的研究与开发,1997,9(4):53.
[5]冯埃生,邹汉法,汪海林,等.高效液相色谱-挥发激光散射检测器检测性能基本因素的考察.药物分析杂志,1996,16(6):414.
收稿日期:1999-03-01, 百拇医药
单位:周春玲(辽宁省药品检验所,辽宁 沈阳 110023);鲁静(中国药品生物制品检定所,北京 100050)
关键词:黄芪;黄芪甲甙;高效液相色谱-蒸发光散射检测
中国中药杂志000314 摘 要:目的:建立测定黄芪中黄芪甲甙含量的新方法。方法:采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定。结果:黄芪甲甙在2.02~10.12 μg与峰面积积分值呈良好的线性(r=0.9997,n=5),平均回收率为100.5%。结论:为控制黄芪中黄芪甲甙的含量提供了新的方法。
Determination of Astragaloside Ⅳ in Radix Astragali by HPLC
with Evaporative Light Scattering Detector
, http://www.100md.com
ZHOU Chun-ling
(Liaoning Provincial Institute for Drug Control,Shenyang 110023,Liaoling,China)
LU Jing
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050,China)
Abstract:Objective:To develop a new method for the determination of astragaloside Ⅳ in Radix Astragali.Method:A HPLC-ELSD method was set up,using Hypersil C18 column (150 mm×4.6 mm),acetonitrile-water(1∶2) as mobile phase with a flow rate of 1.0 ml.min-1.The parameters of drift tube and gas flow rate of the detector were set at 105 ℃ and 2.96 L.min-1 respectively.Result:The calibration curve was linear in the range of 2.02~10.12 μg.The average recovery was 100.5%.Conclusion:The active constituent astragaloside Ⅳ in Radix Astragali can be separated effectively.ELSD detection is appropriate for the determination of constituents with end absorption at low ultra-violet wavelengths.
, 百拇医药
Key words:Radix Astragali;astragaloside Ⅳ;HPLC-ELSD▲
黄芪为重要的益气中药,味甘,性温,有补气固表,利尿,托毒,排脓,敛疮,生肌等功效[1]。我国药典规定以豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪A. membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根供药用。研究表明黄芪甲甙为黄芪中的主要有效成分。迄今为止,测定黄芪甲甙的方法主要有薄层扫描法[2],比色法[3],高效液相色谱法[4]。其中高效液相色谱法灵敏度较高,但因低波长紫外检测时,溶剂背景难以消除。本文试用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定了黄芪中黄芪甲甙的含量。
1 仪器与试剂
, 百拇医药
LC-6A型高效液相色谱泵(日本岛津),ELSD-500检测器(美国Alltech公司),GCK3302全自动空气源(北京惠普),3295积分仪(上海惠普)。
乙腈(色谱纯,天津三达生物医学工程有限公司),其它试剂为分析纯,水为蒸馏水。黄芪甲甙对照品(中国药品生物制品检定所),黄芪药材(中国药品生物制品检定所标本馆)的拉丁学名见表2。
2 色谱条件
色谱柱 Hypersil,5 μm(4.6 mm×150 mm),流动相 乙腈-水(1∶2),室温,流速 1.0 ml.min-1。
3 供试品溶液的制备
本品粗粉约1.5 g,精密称定,置索氏提取器中,加甲醇40 ml冷浸过夜,再加甲醇适量,回流4 h,提取液蒸干,残渣加水10 ml微热使溶解,加水饱和正丁醇振摇提取3次,每次20 ml,合并正丁醇液,用氨试液洗2次,每次20 ml,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣加水5 ml使溶解,放冷,通过D101大孔吸附树脂柱(1.5 cm×12cm),50 ml水洗脱,再40%乙醇30 ml洗脱,继70%乙醇50 ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,甲醇溶解并定容至2 ml量瓶中,滤过,为供试品溶液。对照品及各样品色谱图见图1。
, 百拇医药
图1 对照品及不同种黄芪样品的HPLC色谱图
A.对照品 B.A. mongholicus C.A. membranaceus D.A. floridus E.A. chrysopterus F.A. mongholicus(紫外检测器) a.黄芪甲甙
4 线性关系的考察
精密称定黄芪甲甙对照品10.12 mg,加甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中,精密吸取2,4,6,8,10 μl进样,以进样量(自然对数)为横坐标,峰面积积分值(自然对数)为纵坐标,线性回归方程为Y=1.3943X+12.1417,r=0.9997,进样量在2.02~10.12 μg呈良好的线性关系。
5 精密度实验
精密吸取同一份样品10 μl,重复进样6次,RSD=1.4%。
, 百拇医药
6 重现性实验
同一份样品按制备方法平行制备5份,含量平均值为0.78mg.g-1,RSD=2.0%。
7 回收率实验
精密称定已知含量的样品约0.75 g,精密加入黄芪甲甙对照品溶液20 ml(0.02854mg.ml-1),按供试品制备方法制备样品,测定,结果见表1。
表1 回收率测定结果 样品量
mg
测得量
mg
回收率
, 百拇医药
%
x
%
RSD
%
0.5911
1.1841
103.9
0.5881
1.1512
98.7
0.5885
1.1611
, http://www.100md.com
100.3
100.5
3.23
0.6134
1.1619
96.1
0.6065
1.1964
103.3
注:加入量为0.5708 mg
8 样品测定
5个不同植物种的样品,测定结果见表2。
, http://www.100md.com
表2 样品测定结果 mg.g-1 样品
产地或规格
含量
蒙古黄芪A. mongholicus
山西冲正芪
0.67
蒙古黄芪A. mongholicus
张家口
0.47
蒙古黄芪A. mongholicus
陕西
, 百拇医药
0.28
蒙古黄芪A. mongholicus
山西
0.78
蒙古黄芪A. mongholicus
日本
0.17
膜荚黄芪A. membranaceus
黑龙江
0.56
多花黄芪A. floridus
四川
, http://www.100md.com
0.93
金翼黄芪A. chrysopterus
四川
0.99
9 讨论
9.1 曾试验了甲醇-水(40∶60),四氢呋喃-水(25∶75)及乙腈-水(1∶2)等不同流动相,考察黄芪中各成分的分离情况及检测灵敏度,结果表明,采用乙腈-水(1∶2)为流动相时,分离情况良好。
9.2 按流动相的成分和比例,最初设定漂移管温度为100 ℃,气体流速为2.70 L*min-1通过观察基线噪音和信噪比,确定漂移管温度为105 ℃,气体流速为2.96 L*min-1为最佳的实验条件。
, 百拇医药
9.3 实验中尝试供试品溶液制备不经大孔树脂柱处理,但与经大孔树脂柱处理后得到的供试品比较,峰形及样品含量均不及后者,因此柱纯化是必要的。
9.4 同一植物种不同产地的黄芪中黄芪甲甙含量存在着显著差异,可能与不同生长条件及炮制方法有关。不同植物种皂甙类成分色谱存在着差别(见图1)。
9.5 蒸发光散射检测(ELSD)[5]不受流动相溶剂的干扰,对黄芪甲甙类等具紫外末端吸收的物质,检测效果很好。相同色谱条件用紫外检测器测得图谱见图1中F。
参考文献:
[1]中国药典.1995.271.
[2]鲁 静,王宝琴.黄芪甲甙的薄层扫描法测定.中成药,1992,14(6):34.
[3]陆一心.黄芪甲甙定量方法的研究.中成药,1996,18(2):38.
[4]付铁军,李伯刚,及元乔,等.高效液相色谱法测定黄芪注射液中黄芪甲甙的含量.天然产物的研究与开发,1997,9(4):53.
[5]冯埃生,邹汉法,汪海林,等.高效液相色谱-挥发激光散射检测器检测性能基本因素的考察.药物分析杂志,1996,16(6):414.
收稿日期:1999-03-01, 百拇医药