2.5 细胞中ER-α、ER-β蛋白表达情况检测

    采用Western blotting法检测。取“2.4”项下经预处理且处于对数生长期的T-47D细胞，用PBS清洗，经0.25%胰蛋白酶消化后，以1×106个/孔接种于6孔板中，每孔加入含5%CDT-FBS、1%青链霉素双抗的DMEM高糖无酚红培养基2 mL，培养24 h待细胞贴壁后，按“2.4”项下方法分组、给药，每组设3个复孔。培养48 h后收集细胞，经细胞裂解液裂解后，吸取裂解液适量，于4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，取上清液，按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行蛋白定量。经5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液稀释后，于100 ℃变性5 min。每组取变性蛋白20 μg进行SDS-PAGE电泳(电压：120 V，时间：60 min)，电泳结束后转移至PVDF膜上，以封闭液室温封闭15 min，加入相应一抗(稀释度均为1 ∶ 1 000)，4 ℃孵育过夜;用TBST溶液清洗10 min×3次，随后加入二抗(稀释度均为1 ∶ 10 000) ......