清心开窍方及皂苷对AD大鼠学习记忆能力及脑组织凋亡信号转导分子，Aβ及βAPP表达的影响(1)
[摘要] 目的：探讨清心开窍方及其皂苷成分对Aβ2535杏仁核注射诱导AD大鼠学习记忆能力及脑组织凋亡信号转导分子，Aβ及βAPP表达的影响。方法：雄性SD大鼠40只，随机分为正常组、模型组、安理申组、清心开窍方组和皂苷组，每组8只。采用双侧杏仁核注射Aβ2535(10 g·L -1)制造AD大鼠模型，造模后第2天起，分别灌胃给药安理申(167 mg·kg-1)、清心开窍方水煎剂(1267 mL·kg-1)、皂苷(630 mg·kg-1)及双蒸水，2周后，观察大鼠水迷宫空间记忆能力，并通过免疫组化方法研究脑组织Caspase3，Aβ及βAPP的表达。结果：中药各组能明显改善AD大鼠学习记忆能力，与对照组比较有显著性差异(P<005，P<001)；清心开窍方组、皂苷组大鼠大脑皮层、海马区Caspase3，Aβ及βAPP表达水平降低，与模型组比较差异非常显著(P<001，P<005)。结论：清心开窍方及其皂苷能显著改善AD大鼠学习记忆的能力，可能是通过降低皮质、海马Caspase3，Aβ及βAPP表达发挥作用。
[关键词] 阿尔茨海默病；清心开窍方；凋亡信号转导分子；β淀粉样蛋白
, http://www.100md.com
1 材料与方法
11 动物 SPF级SD大鼠40只，雄性，体重(250±20) g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(湘)20090004。
12 药物与试剂 Aβ2535由北京博奥森生物技术有限公司生产，聚集态Aβ2535按说明书配置。清心开窍方由生地6 g、麦冬6 g、白芍6 g、石斛6 g、丹皮6 g、茯神6 g、陈皮4 g、知母5 g、石菖蒲6 g等组成，湖南中医药大学附属第一医院药剂科提供。经水提醇沉法得到80%的初提药液，然后采用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等提取分离，得到含70%总皂苷成分的清心开窍方有效部位[5]；盐酸多奈哌齐片(安理申)，卫材(中国)药业有限公司生产，批号100223A，蒸馏水制成浓度50%的混悬液。Caspase3免疫组化试剂盒，Aβ免疫组化试剂盒，βAPP免疫组化试剂盒，SABC试剂盒，DAB显色剂由武汉博士德生物工程有限公司提供。
, 百拇医药 13 仪器 BMJ1生物组织包埋机(天津航空机电公司)；Shandon325型石蜡切片机(英国Shandon公司)；DNP9162型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；LEICA DM LB2型双目显微镜(德国LEICA公司)；Motic B5显微摄像系统(麦克奥迪实业集团公司)；MIAS医学图象分析系统(北航公司)。
14 痴呆模型制备 大鼠经环境适应性饲养1周后，于造模前进行Morris水迷宫训练[6]3 d，剔除差异明显者。选取32只，参照文献方法[79]，将Aβ2535注入大鼠双侧杏仁核制备AD模型。2%戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，脑立体定位仪固定头部，常规消毒皮肤，在颅顶中线做长2～3 cm的切口，分离骨膜，暴露前囟，参照大鼠脑立体定位图谱，立体定位杏仁核(以前囟为零点，AP -32 mm，ML ±45 mm，DV 85 mm)后，牙科钻钻开颅骨，用微量注射器将1 μL(10 g·L -1)的Aβ2535分别在5 min内缓慢注入双侧杏仁核，留针5 min，去针以局部软组织封闭针孔，缝合手术切口并消毒。
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15 动物分组及给药方法 大鼠造模称重后随机分为模型组、安理申组(167 mg·kg-1)、清心开窍方水煎剂组(1267 mL·kg-1)及清心开窍方总皂苷组(630 mg·kg-1)，每组8只。另选取8只为正常对照组。依标准动物体质量法[10]，清心开窍方组、皂苷组及安理申组分别给予相当于60 kg成人用药量的20倍。正常组、模型组给予等量双蒸水灌胃，各组均于造模后第2天灌胃干预，每天1次，连续2周。水迷宫测试期间于测试前30 min给药。
16 行为学检测 每次给药结束后进行Morris水迷宫测试，在水池中注入清水，水面高出平台2 cm，水温控制在(21±15) ℃。平台置于某一象限中间，在其他3个象限中任选一入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠逃避潜伏期及跨越平台次数。逃避潜伏期采用定位航行实验[6]。大鼠面向池壁从A，B，C，D入水点放入水中，观察其在60 s内寻找到并爬上平台的时间。若60 s未找到平台，实验者将其牵引至平台上，停留10 s后放回笼中，潜伏期记为60 s，每天2次，连续5 d。跨越平台次数采用空间探索实验[6]。第6天撤除平台，记录大鼠在60 s 内跨越平台相应位置的次数。重复2次，取平均值。
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17 大鼠大脑皮层与海马区Caspase3，Aβ及
βAPP检测 第15天处死动物，冰台上迅速取出大脑组织，放入4%多聚甲醛固定液中固定，将固定好的大脑组织取出，室温下经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切片厚度5 μm。按照免疫组化试剂盒说明书进行染色与检测，采用图像分析系统，每组选取6张切片，每张切片随机观察5个视野，精确选取视野内所有阳性颗粒，计算机自动算出面密度(阳性目标总面积/统计场总面积)，用于定量表达免疫组化阳性反应程度。
18 统计学方法 采用SPSS 160软件，实验数据以±s表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间方差分析采用F检验，组间比较采用SNKq检验，P<005为差异有统计学意义。
2 结果
21 大鼠学习记忆能力和空间探索能力比较 各组大鼠第1，2天逃避潜伏期比较，差异无统计学意义；与正常组比较，模型组第3～5天逃避潜伏期明显延长，跨越平台次数减少，差异有统计学意义(P<001)；与模型组比较，各用药组第3～5天逃避潜伏期均缩短，跨越平台次数增加，差异有统计学意义(P<001，P<005)，见表1。
3 讨论, http://www.100md.com(楚生辉 胡海燕 谭展望 陈翔 王文花 张晓艳)
[关键词] 阿尔茨海默病；清心开窍方；凋亡信号转导分子；β淀粉样蛋白
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1 材料与方法
11 动物 SPF级SD大鼠40只，雄性，体重(250±20) g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(湘)20090004。
12 药物与试剂 Aβ2535由北京博奥森生物技术有限公司生产，聚集态Aβ2535按说明书配置。清心开窍方由生地6 g、麦冬6 g、白芍6 g、石斛6 g、丹皮6 g、茯神6 g、陈皮4 g、知母5 g、石菖蒲6 g等组成，湖南中医药大学附属第一医院药剂科提供。经水提醇沉法得到80%的初提药液，然后采用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等提取分离，得到含70%总皂苷成分的清心开窍方有效部位[5]；盐酸多奈哌齐片(安理申)，卫材(中国)药业有限公司生产，批号100223A，蒸馏水制成浓度50%的混悬液。Caspase3免疫组化试剂盒，Aβ免疫组化试剂盒，βAPP免疫组化试剂盒，SABC试剂盒，DAB显色剂由武汉博士德生物工程有限公司提供。
, 百拇医药 13 仪器 BMJ1生物组织包埋机(天津航空机电公司)；Shandon325型石蜡切片机(英国Shandon公司)；DNP9162型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；LEICA DM LB2型双目显微镜(德国LEICA公司)；Motic B5显微摄像系统(麦克奥迪实业集团公司)；MIAS医学图象分析系统(北航公司)。
14 痴呆模型制备 大鼠经环境适应性饲养1周后，于造模前进行Morris水迷宫训练[6]3 d，剔除差异明显者。选取32只，参照文献方法[79]，将Aβ2535注入大鼠双侧杏仁核制备AD模型。2%戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，脑立体定位仪固定头部，常规消毒皮肤，在颅顶中线做长2～3 cm的切口，分离骨膜，暴露前囟，参照大鼠脑立体定位图谱，立体定位杏仁核(以前囟为零点，AP -32 mm，ML ±45 mm，DV 85 mm)后，牙科钻钻开颅骨，用微量注射器将1 μL(10 g·L -1)的Aβ2535分别在5 min内缓慢注入双侧杏仁核，留针5 min，去针以局部软组织封闭针孔，缝合手术切口并消毒。
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15 动物分组及给药方法 大鼠造模称重后随机分为模型组、安理申组(167 mg·kg-1)、清心开窍方水煎剂组(1267 mL·kg-1)及清心开窍方总皂苷组(630 mg·kg-1)，每组8只。另选取8只为正常对照组。依标准动物体质量法[10]，清心开窍方组、皂苷组及安理申组分别给予相当于60 kg成人用药量的20倍。正常组、模型组给予等量双蒸水灌胃，各组均于造模后第2天灌胃干预，每天1次，连续2周。水迷宫测试期间于测试前30 min给药。
16 行为学检测 每次给药结束后进行Morris水迷宫测试，在水池中注入清水，水面高出平台2 cm，水温控制在(21±15) ℃。平台置于某一象限中间，在其他3个象限中任选一入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠逃避潜伏期及跨越平台次数。逃避潜伏期采用定位航行实验[6]。大鼠面向池壁从A，B，C，D入水点放入水中，观察其在60 s内寻找到并爬上平台的时间。若60 s未找到平台，实验者将其牵引至平台上，停留10 s后放回笼中，潜伏期记为60 s，每天2次，连续5 d。跨越平台次数采用空间探索实验[6]。第6天撤除平台，记录大鼠在60 s 内跨越平台相应位置的次数。重复2次，取平均值。
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17 大鼠大脑皮层与海马区Caspase3，Aβ及
βAPP检测 第15天处死动物，冰台上迅速取出大脑组织，放入4%多聚甲醛固定液中固定，将固定好的大脑组织取出，室温下经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切片厚度5 μm。按照免疫组化试剂盒说明书进行染色与检测，采用图像分析系统，每组选取6张切片，每张切片随机观察5个视野，精确选取视野内所有阳性颗粒，计算机自动算出面密度(阳性目标总面积/统计场总面积)，用于定量表达免疫组化阳性反应程度。
18 统计学方法 采用SPSS 160软件，实验数据以±s表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间方差分析采用F检验，组间比较采用SNKq检验，P<005为差异有统计学意义。
2 结果
21 大鼠学习记忆能力和空间探索能力比较 各组大鼠第1，2天逃避潜伏期比较，差异无统计学意义；与正常组比较，模型组第3～5天逃避潜伏期明显延长，跨越平台次数减少，差异有统计学意义(P<001)；与模型组比较，各用药组第3～5天逃避潜伏期均缩短，跨越平台次数增加，差异有统计学意义(P<001，P<005)，见表1。
3 讨论, http://www.100md.com(楚生辉 胡海燕 谭展望 陈翔 王文花 张晓艳)