夏枯草花粉离体萌发观察(1)
[摘要] 选用唇形科植物夏枯草花粉为材料，通过在离体条件下花粉的萌发来探讨夏枯草花粉萌发的最适条件。以10% H3BO4，30% Ca(NO3)2，20% MgSO4，10%KNO3配制成无机盐溶液为基本培养基， 统计不同相对分子质量的PEG，不同浓度的蔗糖，不同pH和不同温度条件以及不同采集时间下花粉萌发率的情况。夏枯草花粉萌发的最适液体培养条件是：10% H3BO4+30% Ca(NO3)2+20% MgSO4+10% KNO3+25% PEG4000，pH在6.5左右，刚刚开花时采集的花粉在此条件下花粉萌发率最高。
[关键词] 夏枯草；花粉；离体萌发条件
[稿件编号] 20120831011
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30772730，81072986)；国家大学生创新性试验计划项目(111030722)；南京农业大学SRT计划项目(114A29)
, 百拇医药
[通信作者] *郭巧生，Tel：(025)84395980，Email：gqs@njau.edu.cn
夏枯草Prunella vulgaris L.为多年生草本，轮伞花序集成穗状，花萼二唇形；花冠紫色，上唇顶端微凹，下唇中间裂片边缘有细条裂。花期5～6月。
夏枯草干燥果穗入药，苦、辛、寒，入肝、胆经。清火明目，治目赤肿痛、头痛；清肝火、降血压，治高血压病、高血脂和高血糖；散结消肿，治瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛。
花粉是有性繁殖植物重要的遗传物质载体，其活力的有无直接影响种子结实与否。花粉萌发是一个复杂的过程，涉及到体内许多生理生化反应[1]。研究花粉的离体萌发特性，对于雄配子体的生物学研究和杂交育种、良种繁育、花粉培养等都具有重要的意义。有资料显示，人工辅助授粉或杂交授粉是常规育种研究中培育新品种的重要途径，而花粉生活力检测是人工授粉的重要环节，因此，开展夏枯草花粉生活力的研究，可以为杂交育种提供有力的理论基础。花粉生活力的测定方法常用有：花粉萌发、核及原生质染色、荧光染色法及其他染色法[23]。其中花粉萌发法更接近自然实际情况，而且这种方法还为以克服不亲和性为目的的人工受精和通过花粉进行基因转移等新技术研究奠定基础。
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目前没有关于夏枯草花粉离体培养的相关报道，但近年来，国内外不少学者在马铃薯[4]、茶树[5]、陆地棉[6]、乌头[7]等植物花粉活性测定方面进行了研究，认为离体萌发法是测定花粉生活力状况的最简单、可靠的有力手段。同时还发现培养基种类、不同浓度的蔗糖，PEG，H3BO4，Ca(NO3)2，pH梯度以及培养温度、培养时间、花粉采集时间对花粉萌发有很大的影响[813]，且不同植物对萌发的要求不同，可见有关花粉离体萌发的研究已经成熟。本实验旨在研究夏枯草花粉离体培养的最佳条件。为夏枯草人工授粉及更进一步的研究提供基础资料和技术参考，并为其栽培生产和育种实践提供依据。
1 材料与方法
1.1 夏枯草 试验所用夏枯草由南京农业大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为唇形科植物夏枯草P. vulgaris，栽种于南京农业大学。
1.2 花粉采集方法 采集当天开的花粉，均匀的撒在凹形载玻片的凹槽中，将培养液滴入凹槽中，使花粉与培养液充分均匀接触，然后将载玻片放入垫有湿润滤纸的培养皿中，在30 ℃恒温培养箱中培养3 h。
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1.3 花粉最适萌发条件选择与花粉萌发率测定 根据李自刚对唇形科植物黄芩的研究，其花粉在BK培养基上萌发率较高[14]，夏枯草也为唇形科植物，因此选择BK为基本培养基，BK成分为10% H3BO4，30% Ca(NO3)2， 20% MgSO4， 10%KNO3，通过更改单一组分的浓度或调整pH， 研究每种培养基组分对萌发的不同影响情况：相对分子质量为1 500，4 000，6 000的PEG；PEG梯度为5%，15%，25%，35%，45%；蔗糖梯度为0%，5%，15%，25%；pH梯度为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0；温度梯度为25，30，35，40，45 ℃。确定最适条件，再测定单花期内花粉活力，分别采集花开前0.5 h，花开后0，2，4，6，8，10，24 h的夏枯草花粉测定花粉活力，比较单花开放期间花粉活力的变化。
培养时间3 h后，在显微镜下统计花粉萌发率，以花粉管长度大于花粉粒直径为萌发标准，每个条件做2张片，每个凹槽观察5个视野，每个视野的花粉数目不少于50粒。
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花粉萌发率=(已萌发的花粉数/花粉粒总数)×100%
2 结果与分析
2.1 不同相对分子质量、不同浓度的PEG水溶液对花粉萌发率的影响 PEG有较大的黏度，比较接近柱头表面的物理状态，能使花粉缓慢水合，较长久地维持花粉膨压；加入PEG的培养基密度增大，花粉一般浮于表面，有利呼吸，因此PEG能有效增加花粉的离体萌发。不同相对分子质量、不同浓度效果也不一样(表1)，花粉萌发最适为25%PEG4000，其萌发率达26.92%。
表1 PEG水溶液对花粉萌发的影响
Table 1 Effects of PEG aqueous solution on the pollen germination%
注：Duncan检验，不同字母表示差异显著，P<0.05(表2～6同)。
2.2 在基本培养基中添加不同分子量、不同浓度的PEG对花粉萌发率的影响 在基本培养基[10% H3BO4，30% Ca(NO3)2，20% MgSO4，10%KNO3]中再加入不同相对分子质量、不同浓度的PEG(表2)。观察到25%的PEG4000时，萌发率达到最大值。
2.3 不同浓度蔗糖对花粉萌发率的影响 研究表明，植物花粉萌发过程中， 蔗糖不但可以提供营养物质和碳源， 同时还起到调节环境渗透压的作用，同样，渗透压过大，也会对花粉细胞会造成损伤。当蔗糖浓度为0时，花粉萌发率最大，为48.10%，随着浓度的增大而减小，说明一定浓度蔗糖对夏枯草, http://www.100md.com(李义敏，万德乾，郭巧生，谢越盛，周曼)
[关键词] 夏枯草；花粉；离体萌发条件
[稿件编号] 20120831011
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30772730，81072986)；国家大学生创新性试验计划项目(111030722)；南京农业大学SRT计划项目(114A29)
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[通信作者] *郭巧生，Tel：(025)84395980，Email：gqs@njau.edu.cn
夏枯草Prunella vulgaris L.为多年生草本，轮伞花序集成穗状，花萼二唇形；花冠紫色，上唇顶端微凹，下唇中间裂片边缘有细条裂。花期5～6月。
夏枯草干燥果穗入药，苦、辛、寒，入肝、胆经。清火明目，治目赤肿痛、头痛；清肝火、降血压，治高血压病、高血脂和高血糖；散结消肿，治瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛。
花粉是有性繁殖植物重要的遗传物质载体，其活力的有无直接影响种子结实与否。花粉萌发是一个复杂的过程，涉及到体内许多生理生化反应[1]。研究花粉的离体萌发特性，对于雄配子体的生物学研究和杂交育种、良种繁育、花粉培养等都具有重要的意义。有资料显示，人工辅助授粉或杂交授粉是常规育种研究中培育新品种的重要途径，而花粉生活力检测是人工授粉的重要环节，因此，开展夏枯草花粉生活力的研究，可以为杂交育种提供有力的理论基础。花粉生活力的测定方法常用有：花粉萌发、核及原生质染色、荧光染色法及其他染色法[23]。其中花粉萌发法更接近自然实际情况，而且这种方法还为以克服不亲和性为目的的人工受精和通过花粉进行基因转移等新技术研究奠定基础。
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目前没有关于夏枯草花粉离体培养的相关报道，但近年来，国内外不少学者在马铃薯[4]、茶树[5]、陆地棉[6]、乌头[7]等植物花粉活性测定方面进行了研究，认为离体萌发法是测定花粉生活力状况的最简单、可靠的有力手段。同时还发现培养基种类、不同浓度的蔗糖，PEG，H3BO4，Ca(NO3)2，pH梯度以及培养温度、培养时间、花粉采集时间对花粉萌发有很大的影响[813]，且不同植物对萌发的要求不同，可见有关花粉离体萌发的研究已经成熟。本实验旨在研究夏枯草花粉离体培养的最佳条件。为夏枯草人工授粉及更进一步的研究提供基础资料和技术参考，并为其栽培生产和育种实践提供依据。
1 材料与方法
1.1 夏枯草 试验所用夏枯草由南京农业大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为唇形科植物夏枯草P. vulgaris，栽种于南京农业大学。
1.2 花粉采集方法 采集当天开的花粉，均匀的撒在凹形载玻片的凹槽中，将培养液滴入凹槽中，使花粉与培养液充分均匀接触，然后将载玻片放入垫有湿润滤纸的培养皿中，在30 ℃恒温培养箱中培养3 h。
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1.3 花粉最适萌发条件选择与花粉萌发率测定 根据李自刚对唇形科植物黄芩的研究，其花粉在BK培养基上萌发率较高[14]，夏枯草也为唇形科植物，因此选择BK为基本培养基，BK成分为10% H3BO4，30% Ca(NO3)2， 20% MgSO4， 10%KNO3，通过更改单一组分的浓度或调整pH， 研究每种培养基组分对萌发的不同影响情况：相对分子质量为1 500，4 000，6 000的PEG；PEG梯度为5%，15%，25%，35%，45%；蔗糖梯度为0%，5%，15%，25%；pH梯度为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0；温度梯度为25，30，35，40，45 ℃。确定最适条件，再测定单花期内花粉活力，分别采集花开前0.5 h，花开后0，2，4，6，8，10，24 h的夏枯草花粉测定花粉活力，比较单花开放期间花粉活力的变化。
培养时间3 h后，在显微镜下统计花粉萌发率，以花粉管长度大于花粉粒直径为萌发标准，每个条件做2张片，每个凹槽观察5个视野，每个视野的花粉数目不少于50粒。
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花粉萌发率=(已萌发的花粉数/花粉粒总数)×100%
2 结果与分析
2.1 不同相对分子质量、不同浓度的PEG水溶液对花粉萌发率的影响 PEG有较大的黏度，比较接近柱头表面的物理状态，能使花粉缓慢水合，较长久地维持花粉膨压；加入PEG的培养基密度增大，花粉一般浮于表面，有利呼吸，因此PEG能有效增加花粉的离体萌发。不同相对分子质量、不同浓度效果也不一样(表1)，花粉萌发最适为25%PEG4000，其萌发率达26.92%。
表1 PEG水溶液对花粉萌发的影响
Table 1 Effects of PEG aqueous solution on the pollen germination%
注：Duncan检验，不同字母表示差异显著，P<0.05(表2～6同)。
2.2 在基本培养基中添加不同分子量、不同浓度的PEG对花粉萌发率的影响 在基本培养基[10% H3BO4，30% Ca(NO3)2，20% MgSO4，10%KNO3]中再加入不同相对分子质量、不同浓度的PEG(表2)。观察到25%的PEG4000时，萌发率达到最大值。
2.3 不同浓度蔗糖对花粉萌发率的影响 研究表明，植物花粉萌发过程中， 蔗糖不但可以提供营养物质和碳源， 同时还起到调节环境渗透压的作用，同样，渗透压过大，也会对花粉细胞会造成损伤。当蔗糖浓度为0时，花粉萌发率最大，为48.10%，随着浓度的增大而减小，说明一定浓度蔗糖对夏枯草, http://www.100md.com(李义敏，万德乾，郭巧生，谢越盛，周曼)