应用反相高效制备液相同时分离川芎中阿魏酸、洋川芎内酯I和H(1)
[摘要] 利用制备型反相高效液相色谱(pre-HPLC)，从川芎中分离制备阿魏酸、洋川芎内酯I和洋川芎内酯H，并进行结构鉴定。制备色谱条件：Shim-Pack Prep-ODS色谱柱(20.0 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.2%冰醋酸溶液(50∶50)，体积流量5 mL·min-1，进样体积1 mL，检测波长278 nm。经分析 HPLC测定纯度，用UV，MS，NMR等对其进行结构鉴定。鉴定结果确定为阿魏酸、洋川芎内酯I和洋川芎内酯H。质量分数大于98%。该方法简便、快速，制备阿魏酸、洋川芎内酯I和洋川芎内酯H质量分数很高，既适于用作对照品，也可满足新药研发的需要。
[关键词] 反相高效制备液相；川芎；阿魏酸；洋川芎内酯I；洋川芎内酯H
川芎Ligusticum chuanxiong Hort.，自古以来在中医临床上就用来治疗各种血证，有行气活血，祛风止痛之功效，为活血化瘀常用中药。川芎中化学成分主要包括川芎嗪、阿魏酸和藁本内酯等化合物，川芎嗪一直被认为是川芎中的主要活性成分，但近期研究表明，川芎中的内酯类成分才是川芎的主要活性成分[1-5]，川芎内酯类化合物能通过血脑屏障，具有抗血小板聚集、扩张血管、抗脑缺血、减轻脑缺血损伤等作用。前期的研究中[6]，从川芎抗偏头痛效应组分中分离得到了藁本内酯的氧化衍生物洋川芎内酯I。血清药物化学研究表明，阿魏酸和洋川芎内酯I为川芎效应组分中入血的的主要成分，洋川芎内酯I为既入血又入脑的成分[7-8]。三者化学性质都不稳定，在高温和碱性条件下易发生分解、缩合等反应[9-12]。采用传统的分离纯化方法，操作繁杂，分离效率低，难以获得三者高纯度的单体。制备液相色谱法不受样品挥发性和热稳定性的限制，分离效能高、分析速度快、检测灵敏，操作简单，重现性好，适合分离纯化不稳定的天然产物。本文使用反相高效制备液相色谱从中药川芎中同时分离制备阿魏酸、洋川芎内酯I和洋川芎内酯H，为川芎效应组分的临床前药学研究奠定了基础。
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1 材料
Shimadzu LC-6AD制备型高效液相色谱仪(日本岛津制作所)，包括 SPD-20A prominence UV/Vis Detector，LC-8ADvp两元泵，N2000色谱数据工作站(浙江大学智能信息工程研究所)，Agilent1200高效液相色谱仪，包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(美国安捷伦公司)，Agilent Chem Station色谱数据工作站，Synapt G2 quadrupoletime-of-flight(Q/TOF)tandem 质谱仪(美国Waters公司)，Avance DMX-500(500 MHz)核磁共振仪(德国 Bruker Biopsin 公司)，TGL-18c台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，SK-5200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)，微量移液枪(Thermo公司)，XP205电子分析天平(梅特勒-托利多上海仪器公司)。
, 百拇医药 川芎药材(批号20110627，产地四川，上海康桥饮片公司)，经上海中医药大学赵志礼教授鉴定为伞形科植物川芎L. chuanxiong的干燥根茎；阿魏酸对照品(批号 0773-9910，中国食品药品检定研究院)，洋川芎内酯I和H对照品(本实验室提取、精制，NMR光谱鉴定，经归一化法测定质量分数大于99.10%)，甲醇、乙腈(色谱纯，Merk公司)，超纯水(自制，Milli-Q超纯水系统)，其余试剂均为分析纯(国药集团化学试剂厂)。
2 方法与结果
2.1 样品前处理
将200 g川芎药材粉碎成粗粉，取川芎粗粉一定量，加70%乙醇10倍量(质量/体积)，加热提取2次(2，1.5 h)，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，收干，所得浸膏用20 mL乙醇溶解，加入200 mL蒸馏水沉降杂质，滤过，取上清液，上HPD-100大孔树脂，吸附流速为40 mL·h-1，蒸馏水洗100 mL后，用70%乙醇洗脱200 mL，减压蒸去溶剂得到粗提物。
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2.2 色谱条件
2.2.1 分析型HPLC Megres C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测波长278 nm；流动相乙腈-0.5%冰醋酸溶液(25∶75)；流速1 mL·min-1；进样体积10 μL；柱温30 ℃；理论塔板数以洋川芎内酯I计不低于5 000。
2.2.2 制备型HPLC Shim-Pack Prep-ODS(20.0 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.2%冰醋酸溶液(50∶50)；检测波长为280 nm；体积流量5 mL·min-1；进样体积1 mL。
2.3 纯品的制备
取 2.1项下的粗提物，用甲醇超声溶解，制成20 g·L-1的样品，经滤膜(0.45 μm)滤过后备用，利用制备型HPLC分离制备，按上述制备色谱条件洗脱，经多次进样，收集22.4～24.2，37.6～39.5，44.2～45.6 min 3段组分(图1)，用1 mol·L-1的NaHCO3调节pH至6～7，减压收干后用乙酸乙酯复溶，过滤，收干上清液，得到化合物 1(123 mg)， 2(217 mg)， 3(21 mg)。
2.4 纯度检测
使用高效液相色谱法对分离得到的产品纯度进行检测，按峰面积归一化法计算，化合物 1，2，3的纯度均大于98%(图2)，外标法定量确定产品质量分数分别为98.0%，99.1%，98.2%，其得率分别为0.06%，0.11%，0.01%(占药材总量)。, 百拇医药(熊耀坤 梁爽 洪燕龙 杨秀娟 沈岚 杜焰 冯怡)
[关键词] 反相高效制备液相；川芎；阿魏酸；洋川芎内酯I；洋川芎内酯H
川芎Ligusticum chuanxiong Hort.，自古以来在中医临床上就用来治疗各种血证，有行气活血，祛风止痛之功效，为活血化瘀常用中药。川芎中化学成分主要包括川芎嗪、阿魏酸和藁本内酯等化合物，川芎嗪一直被认为是川芎中的主要活性成分，但近期研究表明，川芎中的内酯类成分才是川芎的主要活性成分[1-5]，川芎内酯类化合物能通过血脑屏障，具有抗血小板聚集、扩张血管、抗脑缺血、减轻脑缺血损伤等作用。前期的研究中[6]，从川芎抗偏头痛效应组分中分离得到了藁本内酯的氧化衍生物洋川芎内酯I。血清药物化学研究表明，阿魏酸和洋川芎内酯I为川芎效应组分中入血的的主要成分，洋川芎内酯I为既入血又入脑的成分[7-8]。三者化学性质都不稳定，在高温和碱性条件下易发生分解、缩合等反应[9-12]。采用传统的分离纯化方法，操作繁杂，分离效率低，难以获得三者高纯度的单体。制备液相色谱法不受样品挥发性和热稳定性的限制，分离效能高、分析速度快、检测灵敏，操作简单，重现性好，适合分离纯化不稳定的天然产物。本文使用反相高效制备液相色谱从中药川芎中同时分离制备阿魏酸、洋川芎内酯I和洋川芎内酯H，为川芎效应组分的临床前药学研究奠定了基础。
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1 材料
Shimadzu LC-6AD制备型高效液相色谱仪(日本岛津制作所)，包括 SPD-20A prominence UV/Vis Detector，LC-8ADvp两元泵，N2000色谱数据工作站(浙江大学智能信息工程研究所)，Agilent1200高效液相色谱仪，包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(美国安捷伦公司)，Agilent Chem Station色谱数据工作站，Synapt G2 quadrupoletime-of-flight(Q/TOF)tandem 质谱仪(美国Waters公司)，Avance DMX-500(500 MHz)核磁共振仪(德国 Bruker Biopsin 公司)，TGL-18c台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，SK-5200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)，微量移液枪(Thermo公司)，XP205电子分析天平(梅特勒-托利多上海仪器公司)。
, 百拇医药 川芎药材(批号20110627，产地四川，上海康桥饮片公司)，经上海中医药大学赵志礼教授鉴定为伞形科植物川芎L. chuanxiong的干燥根茎；阿魏酸对照品(批号 0773-9910，中国食品药品检定研究院)，洋川芎内酯I和H对照品(本实验室提取、精制，NMR光谱鉴定，经归一化法测定质量分数大于99.10%)，甲醇、乙腈(色谱纯，Merk公司)，超纯水(自制，Milli-Q超纯水系统)，其余试剂均为分析纯(国药集团化学试剂厂)。
2 方法与结果
2.1 样品前处理
将200 g川芎药材粉碎成粗粉，取川芎粗粉一定量，加70%乙醇10倍量(质量/体积)，加热提取2次(2，1.5 h)，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，收干，所得浸膏用20 mL乙醇溶解，加入200 mL蒸馏水沉降杂质，滤过，取上清液，上HPD-100大孔树脂，吸附流速为40 mL·h-1，蒸馏水洗100 mL后，用70%乙醇洗脱200 mL，减压蒸去溶剂得到粗提物。
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2.2 色谱条件
2.2.1 分析型HPLC Megres C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测波长278 nm；流动相乙腈-0.5%冰醋酸溶液(25∶75)；流速1 mL·min-1；进样体积10 μL；柱温30 ℃；理论塔板数以洋川芎内酯I计不低于5 000。
2.2.2 制备型HPLC Shim-Pack Prep-ODS(20.0 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.2%冰醋酸溶液(50∶50)；检测波长为280 nm；体积流量5 mL·min-1；进样体积1 mL。
2.3 纯品的制备
取 2.1项下的粗提物，用甲醇超声溶解，制成20 g·L-1的样品，经滤膜(0.45 μm)滤过后备用，利用制备型HPLC分离制备，按上述制备色谱条件洗脱，经多次进样，收集22.4～24.2，37.6～39.5，44.2～45.6 min 3段组分(图1)，用1 mol·L-1的NaHCO3调节pH至6～7，减压收干后用乙酸乙酯复溶，过滤，收干上清液，得到化合物 1(123 mg)， 2(217 mg)， 3(21 mg)。
2.4 纯度检测
使用高效液相色谱法对分离得到的产品纯度进行检测，按峰面积归一化法计算，化合物 1，2，3的纯度均大于98%(图2)，外标法定量确定产品质量分数分别为98.0%，99.1%，98.2%，其得率分别为0.06%，0.11%，0.01%(占药材总量)。, 百拇医药(熊耀坤 梁爽 洪燕龙 杨秀娟 沈岚 杜焰 冯怡)