痰瘀同治方对小型猪冠状动脉粥样硬化炎症反应的影响(1)
[摘要]目的：观察痰瘀同治方对小型猪冠状动脉动脉粥样硬化炎症反应的抑制作用。
方法：将36只中国小型猪随机分为正常对照组，模型组，舒降之组和痰瘀同治方高、中、低剂量组(生药2.0，1.0，0.5 g·kg-1)，每组6只；除对照组外，其他各组均给予高脂饲料喂养 2周后，采用介入技术球囊损伤冠状动脉左前降支内皮，术后继续高脂饲料喂养8周，制备小型猪冠状动脉粥样硬化模型；术后给药8周，采用血管内超声观察各组动物冠状动脉斑块负荷，进行冠状动脉病理形态学观察，ELISA法测定血清超敏性C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein， hs-CRP)，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)-α和白介素(interleukin， IL)-6等炎症因子水平。采用免疫组化的方法观察冠状动脉血管壁NF-κB p65核移位的表达。
结果：与对照组比较，模型组动物在实验结束时冠状动脉斑块负荷明显增加(P<0.01)，冠状动脉病变血管组织结构改变明显异常，管腔狭窄，出现大量的泡沫细胞以及炎细胞侵润；循环中hs-CRP，TNF-α及IL-6水平均显著升高(P<0.01)；免疫组化显示模型组小型猪冠脉NF-κB p65核移位显著增加。与模型组比较，痰瘀同治方能够明显减轻AS斑块负荷(P<0.01)，抑制管腔狭窄，减少炎细胞侵润，降低血清hs-CRP，TNF-α和IL-6等炎症细胞因子水平并抑制冠脉NF-κB p65核移位(P<0.05或P<0.01)。
, http://www.100md.com
结论：痰瘀同治方能够通过控制NF-κB p65核移位而降低下游炎症反应，从而抑制中国小型猪冠状动脉粥样硬化斑块的发生和发展。
[关键词]痰瘀同治方；冠状动脉动脉粥样硬化；中国小型猪；炎症
[收稿日期]2013-07-11
[基金项目]国家“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX09502-017，2012ZX09301002-004)；北京市科技专项；中药药理北京市重点实验室2012年阶梯计划项目(z121107002812036)
[通信作者]*刘建勋，研究员，博士生导师，E-mail：liujx0324@sina.com
[作者简介]任建勋，博士后出站，主要从事治疗心脑血管疾病的中药新药研发，E-mail：rjx131@sina.com炎症反应在动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)的发生发展全过程中具有关键的作用。目前认为高胆固醇血症、高血压、糖尿病、吸烟及感染等均可通过诱导炎症反应促使AS的形成和发展[1]。大多数缺血性心脑血管事件是由AS斑块破裂导致血栓形成引起，而炎症是诱发斑块破裂的主要原因之一。在AS破裂处常有活化的炎症细胞浸润、平滑肌细胞凋亡、分泌各种基质金属蛋白酶降解纤维帽，最终导致动脉粥样硬化性血栓形成[2]。因此抑制AS病理过程中炎症反应，稳定斑块是近年来AS研究的重点。痰瘀同治方由丹参、川芎、人参等多味中药组成，尽管目前证实以上多个中药都有一定抑制炎症，减少免疫损伤的效应[3-4]。但是否能够通过对AS炎症反应机制的干预而减轻冠状动脉狭窄还需要深入研究。本研究从AS炎症反应的角度出发，观察研究痰瘀同治方对中国小型猪动脉粥样硬化炎症反应的抑制作用，探讨其防治AS的作用机制。
, 百拇医药
1材料
1.1动物中国实验小型猪(Chinese experimental miniature swine， CEMS)，36只，雌雄不拘，体重15～20 kg，由北京北七家美乐养殖场提供，动物合格证号SCXK(京)2013-0005。
1.2药物与试剂痰瘀同治方(TYTZ)，主要由丹参、川芎、人参等中药组成，由中国中医科学院西苑医院基础医学研究所药学研究室提供。辛伐他汀片(舒降之)，杭州默沙东制药有限公司生产，批号100061。戊巴比妥钠，德国进口分装，北京化学试剂公司提供，批号020402；76%复方泛影葡胺注射液，上海旭东海普药业有限公司生产，批号071101；超敏性C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein， hs-CRP)ELISA测定试剂盒，由美国Kamiya biomedical公司提供，批号9768184；肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)-α和白介素(interleukin， IL)-6 ELISA测定试剂盒，均由美国RD公司提供，批号分别为787876，288733。兔抗人NF-κB p65多克隆一抗(ab31481)，Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗和浓缩型DAB试剂盒，均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。高脂饲料配方为每100 kg高脂饲料中含：胆固醇2 kg，胆盐0.5 kg，猪油10 kg，由北京科澳协力饲料有限公司提供，许可证号SCXK(京)2009-0012。
, 百拇医药
1.3仪器MP150多导生理信息分析系统(美国Biopac公司)；BV Pulsera型C型臂X光机(荷兰飞利浦公司)；快速交换PTCA球囊扩张导管(管径=1.3∶1，美国Boston公司)；导引导丝，6F Cordis血管造影导管和球囊(均由美国Abbott公司提供)；20-MHz超声导管(美国Volcano公司)；ICE-CL31R低温离心机(美国Thermo公司)；TEC-7621C型心电监护仪(日本光电公司)；HMIAS-2000病理图像分析系统(北京利金阳科技发展有限公司)；synergy 4酶标仪(美国Biotek公司)。
2方法
2.1小型猪冠状动脉粥样硬化模型的建立根据文献，采用高脂饲料喂养结合冠状动脉血管内皮损伤的方法建立冠状动脉粥样硬化小型猪模型。方法：小型猪以高脂饲料喂养2周，每天每只900 g，在高脂饲料喂养的基础之上，用介入法行冠状动脉血管内皮损伤。具体操作：耳静脉注射戊巴比妥钠(30 mg·kg-1)麻醉后，分离右侧颈总动脉，结扎远心端，置入6F动脉鞘管，从动脉鞘管的侧管注入肝素200 U·kg-1。在C型臂X光机透视下，以6F 35 L右冠导引导管置于左冠状动脉开口行左冠状动脉造影，观察猪冠状动脉的分布情况，造影后置入交换导丝，将导丝置入冠状动脉前降支(left anterior descending branch，LAD)中部，将球囊沿导丝进入LAD中部。根据实验动物间LAD血管直径的差异进行球囊加压8～12大气压(atmosphere，ATM)，持续30 s，反复3次，每次间隔1 min，间隔期间球囊不加压，扩张后维持球囊压力4～6ATM，同时轻微拉动球囊，距离约0.5～1.0 cm。完成后撤除导丝、球囊，再次造影观察LAD扩张情况，撤除导引导管，结扎颈总动脉，伤口清创，局部给予150万U青霉素，无菌缝合，单笼喂养观察，术中连续心电监护。术后继续给予高脂饲料(每天每只900 g)喂养8周。所制备的动物模型血脂水平升高，血液黏度增加，冠状动脉前降支动脉粥样硬化斑块明显形成，心肌出现不同程度的缺血性改变，提示小型猪痰瘀互结证冠心病模型成功。正常对照组仅冠脉造影，不行介入损伤术，仅给予普通饲料喂养，每天每只900 g。, 百拇医药(任建勋 李磊 林成仁 付建华 马悦颖 李军梅 李鸿海 王敏 刘建勋)
方法：将36只中国小型猪随机分为正常对照组，模型组，舒降之组和痰瘀同治方高、中、低剂量组(生药2.0，1.0，0.5 g·kg-1)，每组6只；除对照组外，其他各组均给予高脂饲料喂养 2周后，采用介入技术球囊损伤冠状动脉左前降支内皮，术后继续高脂饲料喂养8周，制备小型猪冠状动脉粥样硬化模型；术后给药8周，采用血管内超声观察各组动物冠状动脉斑块负荷，进行冠状动脉病理形态学观察，ELISA法测定血清超敏性C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein， hs-CRP)，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)-α和白介素(interleukin， IL)-6等炎症因子水平。采用免疫组化的方法观察冠状动脉血管壁NF-κB p65核移位的表达。
结果：与对照组比较，模型组动物在实验结束时冠状动脉斑块负荷明显增加(P<0.01)，冠状动脉病变血管组织结构改变明显异常，管腔狭窄，出现大量的泡沫细胞以及炎细胞侵润；循环中hs-CRP，TNF-α及IL-6水平均显著升高(P<0.01)；免疫组化显示模型组小型猪冠脉NF-κB p65核移位显著增加。与模型组比较，痰瘀同治方能够明显减轻AS斑块负荷(P<0.01)，抑制管腔狭窄，减少炎细胞侵润，降低血清hs-CRP，TNF-α和IL-6等炎症细胞因子水平并抑制冠脉NF-κB p65核移位(P<0.05或P<0.01)。
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结论：痰瘀同治方能够通过控制NF-κB p65核移位而降低下游炎症反应，从而抑制中国小型猪冠状动脉粥样硬化斑块的发生和发展。
[关键词]痰瘀同治方；冠状动脉动脉粥样硬化；中国小型猪；炎症
[收稿日期]2013-07-11
[基金项目]国家“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX09502-017，2012ZX09301002-004)；北京市科技专项；中药药理北京市重点实验室2012年阶梯计划项目(z121107002812036)
[通信作者]*刘建勋，研究员，博士生导师，E-mail：liujx0324@sina.com
[作者简介]任建勋，博士后出站，主要从事治疗心脑血管疾病的中药新药研发，E-mail：rjx131@sina.com炎症反应在动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)的发生发展全过程中具有关键的作用。目前认为高胆固醇血症、高血压、糖尿病、吸烟及感染等均可通过诱导炎症反应促使AS的形成和发展[1]。大多数缺血性心脑血管事件是由AS斑块破裂导致血栓形成引起，而炎症是诱发斑块破裂的主要原因之一。在AS破裂处常有活化的炎症细胞浸润、平滑肌细胞凋亡、分泌各种基质金属蛋白酶降解纤维帽，最终导致动脉粥样硬化性血栓形成[2]。因此抑制AS病理过程中炎症反应，稳定斑块是近年来AS研究的重点。痰瘀同治方由丹参、川芎、人参等多味中药组成，尽管目前证实以上多个中药都有一定抑制炎症，减少免疫损伤的效应[3-4]。但是否能够通过对AS炎症反应机制的干预而减轻冠状动脉狭窄还需要深入研究。本研究从AS炎症反应的角度出发，观察研究痰瘀同治方对中国小型猪动脉粥样硬化炎症反应的抑制作用，探讨其防治AS的作用机制。
, 百拇医药
1材料
1.1动物中国实验小型猪(Chinese experimental miniature swine， CEMS)，36只，雌雄不拘，体重15～20 kg，由北京北七家美乐养殖场提供，动物合格证号SCXK(京)2013-0005。
1.2药物与试剂痰瘀同治方(TYTZ)，主要由丹参、川芎、人参等中药组成，由中国中医科学院西苑医院基础医学研究所药学研究室提供。辛伐他汀片(舒降之)，杭州默沙东制药有限公司生产，批号100061。戊巴比妥钠，德国进口分装，北京化学试剂公司提供，批号020402；76%复方泛影葡胺注射液，上海旭东海普药业有限公司生产，批号071101；超敏性C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein， hs-CRP)ELISA测定试剂盒，由美国Kamiya biomedical公司提供，批号9768184；肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)-α和白介素(interleukin， IL)-6 ELISA测定试剂盒，均由美国RD公司提供，批号分别为787876，288733。兔抗人NF-κB p65多克隆一抗(ab31481)，Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗和浓缩型DAB试剂盒，均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。高脂饲料配方为每100 kg高脂饲料中含：胆固醇2 kg，胆盐0.5 kg，猪油10 kg，由北京科澳协力饲料有限公司提供，许可证号SCXK(京)2009-0012。
, 百拇医药
1.3仪器MP150多导生理信息分析系统(美国Biopac公司)；BV Pulsera型C型臂X光机(荷兰飞利浦公司)；快速交换PTCA球囊扩张导管(管径=1.3∶1，美国Boston公司)；导引导丝，6F Cordis血管造影导管和球囊(均由美国Abbott公司提供)；20-MHz超声导管(美国Volcano公司)；ICE-CL31R低温离心机(美国Thermo公司)；TEC-7621C型心电监护仪(日本光电公司)；HMIAS-2000病理图像分析系统(北京利金阳科技发展有限公司)；synergy 4酶标仪(美国Biotek公司)。
2方法
2.1小型猪冠状动脉粥样硬化模型的建立根据文献，采用高脂饲料喂养结合冠状动脉血管内皮损伤的方法建立冠状动脉粥样硬化小型猪模型。方法：小型猪以高脂饲料喂养2周，每天每只900 g，在高脂饲料喂养的基础之上，用介入法行冠状动脉血管内皮损伤。具体操作：耳静脉注射戊巴比妥钠(30 mg·kg-1)麻醉后，分离右侧颈总动脉，结扎远心端，置入6F动脉鞘管，从动脉鞘管的侧管注入肝素200 U·kg-1。在C型臂X光机透视下，以6F 35 L右冠导引导管置于左冠状动脉开口行左冠状动脉造影，观察猪冠状动脉的分布情况，造影后置入交换导丝，将导丝置入冠状动脉前降支(left anterior descending branch，LAD)中部，将球囊沿导丝进入LAD中部。根据实验动物间LAD血管直径的差异进行球囊加压8～12大气压(atmosphere，ATM)，持续30 s，反复3次，每次间隔1 min，间隔期间球囊不加压，扩张后维持球囊压力4～6ATM，同时轻微拉动球囊，距离约0.5～1.0 cm。完成后撤除导丝、球囊，再次造影观察LAD扩张情况，撤除导引导管，结扎颈总动脉，伤口清创，局部给予150万U青霉素，无菌缝合，单笼喂养观察，术中连续心电监护。术后继续给予高脂饲料(每天每只900 g)喂养8周。所制备的动物模型血脂水平升高，血液黏度增加，冠状动脉前降支动脉粥样硬化斑块明显形成，心肌出现不同程度的缺血性改变，提示小型猪痰瘀互结证冠心病模型成功。正常对照组仅冠脉造影，不行介入损伤术，仅给予普通饲料喂养，每天每只900 g。, 百拇医药(任建勋 李磊 林成仁 付建华 马悦颖 李军梅 李鸿海 王敏 刘建勋)