金叶子异槲皮苷对MC3T3—E1细胞成骨分化的影响(1)
[摘要]该研究对从金叶子中分离得到的异槲皮苷的成骨活性进行了系统评价。在1×10-4，1×10-5，1×10-6， 1×10-7 mol·L-1异槲皮苷浓度作用下检测了MC3T3-E1细胞增殖活力和碱性磷酸酶活性；在异槲皮苷作用的第3天对MC3T3-E1碱性磷酸酶、I型胶原以及转录因子Runx2和Osterix的基因表达水平进行了检测；并通过茜素红染色的方法在第21天对MC3T3-E1进行了胞外基质矿化能力的评价。结果显示，异槲皮苷在1×10-7～1×10-5 mol·L-1能促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化及矿化能力，上调成骨相关基因的表达，而且该作用呈现出一定的浓度依赖性，在浓度为1×10-6 mol·L-1时促进作用最强。在1×10-4 mol·L-1时表现出明显的细胞毒性。因此，从金叶子中分离得到的异槲皮苷有一定的成骨活性，这可能是传统中药金叶子治疗骨折的主要药效成分。
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[关键词]异槲皮苷；MC3T3-E1细胞；增殖；成骨分化
传统中药防治骨质疏松和骨折创伤的主要有效成分为黄酮类化合物[1-5]。这类化合物与雌激素结构相似，因其具有良好的类雌激素作用及较低的副作用，而广泛用于雌激素的替代治疗[6]。云南金叶子是一种民间常用中草药，主要用于治疗风湿关节痛，跌打损伤，骨折等[7]，但其治疗骨相关疾病的药效成分并未明确。异槲皮苷(槲皮素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷)是云南金叶子中的主要黄酮类化合物之一[8-9]。研究表明，异槲皮苷有抗菌，抗氧化及抗神经炎性作用[10-12]，但其成骨活性的研究却未见报道。为此，本实验选择了金叶子中的天然活性成分异槲皮苷，以MC3T3-E1细胞为干预对象，研究了异槲皮苷对细胞增殖、成骨分化功能的影响，为金叶子用于骨创伤疾病的治疗提供实验依据。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 药物与试剂 MC3T3-E1细胞株(中国协和细胞库)，改良型α-MEM培养基(Hyclone公司)，澳洲胎牛血清、1%的青霉素/链霉素双抗试剂、0.25%胰酶(Gibco公司)，CCK-8试剂(北京同仁化学所)，碱性磷酸酶试剂盒(abcam公司)，DMSO、茜素红、抗坏血酸钠、β-甘油磷酸钠、地塞米松和氯化十六烷基吡啶(Sigma)，反转录试剂盒(ToYoBo公司)，实时荧光定量PCR试剂盒(Roche公司，瑞士)。将异槲皮苷(纯度>99%，由昆明理工大学植物化学实验室分离鉴定)溶于DMSO，配制成10 g·L-1的溶液，再用培养基稀释成1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol·L-1的工作溶液。
1.2 MC3T3-E1细胞培养 使用含10%胎牛血清、1%双抗的改良型α-MEM培养基于37 ℃，5%CO2培养箱中培养MC3T3-E1细胞，每3 d换液，传代培养至细胞数量达到实验所需时进行以下的实验。
, 百拇医药
1.3 CCK-8检测 取对数生长期的MC3T3-E1细胞，0.02% EDTA+0.1%胰蛋白酶消化， 制备单细胞悬液，调整浓度以5×104个/mL密度接种于96孔板，每孔100 μL，接种量为5 000个/孔。培养24 h后，分别以浓度为1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol·L-1的异槲皮苷工作液处理细胞，含DMSO[<1 mL·L-1的培养基为阴性对照(Control)]。在1，3，5，7 d于每孔中加入10%的CCK-8试剂，37 ℃避光孵育2 h后，吸取100 μL培养基，570 nm下测A。
1.4 碱性磷酸酶染色 将细胞按2×104个/孔接种于48孔板中，24 h后换含1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol·L-1异槲皮苷培养基，用成骨诱导剂(含1×10-7 mol·L-1地塞米松，50 mg·L-1坏血酸，10 mmol·L-1的β-甘油磷酸)作为阳性对照(OS)，DMSO为阴性对照。第7天吸取上清液做ALP定量检测，按碱性磷酸酶定量试剂盒说明书操作，室温避光孵育1 h后在405 nm处测A。同时将吸去培养基的细胞用PBS清洗3次，然后用70%的乙醇固定30 min，BCIP/NBT染色10 min后加入ddH2O终止反应，再加入ddH2O清洗至溶液无色，晾干后拍照。
1.5 RT-PCR检测 以1×105 个细胞/孔接种于6孔板中。培养24 h后换含1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol·L-1异槲皮苷培养基。于第3天收集各组细胞，加入1 mL Trizol试剂裂解细胞，提取总RNA，利用反转录试剂盒将1 μg RNA反转为cDNA，使用实时荧光定量PCR试剂盒和7500 Real Time PCR 仪进行RT-PCR反应，检测ALP，ColI，Runx2及Osterix的基因表达水平。各基因引物序列见表1。通过2-ΔΔCt计算各基因相对表达量。进行3次独立重复实验。, 百拇医药(段爱竹 邓旭亮 李蓉涛)
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[关键词]异槲皮苷；MC3T3-E1细胞；增殖；成骨分化
传统中药防治骨质疏松和骨折创伤的主要有效成分为黄酮类化合物[1-5]。这类化合物与雌激素结构相似，因其具有良好的类雌激素作用及较低的副作用，而广泛用于雌激素的替代治疗[6]。云南金叶子是一种民间常用中草药，主要用于治疗风湿关节痛，跌打损伤，骨折等[7]，但其治疗骨相关疾病的药效成分并未明确。异槲皮苷(槲皮素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷)是云南金叶子中的主要黄酮类化合物之一[8-9]。研究表明，异槲皮苷有抗菌，抗氧化及抗神经炎性作用[10-12]，但其成骨活性的研究却未见报道。为此，本实验选择了金叶子中的天然活性成分异槲皮苷，以MC3T3-E1细胞为干预对象，研究了异槲皮苷对细胞增殖、成骨分化功能的影响，为金叶子用于骨创伤疾病的治疗提供实验依据。
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1.1 药物与试剂 MC3T3-E1细胞株(中国协和细胞库)，改良型α-MEM培养基(Hyclone公司)，澳洲胎牛血清、1%的青霉素/链霉素双抗试剂、0.25%胰酶(Gibco公司)，CCK-8试剂(北京同仁化学所)，碱性磷酸酶试剂盒(abcam公司)，DMSO、茜素红、抗坏血酸钠、β-甘油磷酸钠、地塞米松和氯化十六烷基吡啶(Sigma)，反转录试剂盒(ToYoBo公司)，实时荧光定量PCR试剂盒(Roche公司，瑞士)。将异槲皮苷(纯度>99%，由昆明理工大学植物化学实验室分离鉴定)溶于DMSO，配制成10 g·L-1的溶液，再用培养基稀释成1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol·L-1的工作溶液。
1.2 MC3T3-E1细胞培养 使用含10%胎牛血清、1%双抗的改良型α-MEM培养基于37 ℃，5%CO2培养箱中培养MC3T3-E1细胞，每3 d换液，传代培养至细胞数量达到实验所需时进行以下的实验。
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1.3 CCK-8检测 取对数生长期的MC3T3-E1细胞，0.02% EDTA+0.1%胰蛋白酶消化， 制备单细胞悬液，调整浓度以5×104个/mL密度接种于96孔板，每孔100 μL，接种量为5 000个/孔。培养24 h后，分别以浓度为1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol·L-1的异槲皮苷工作液处理细胞，含DMSO[<1 mL·L-1的培养基为阴性对照(Control)]。在1，3，5，7 d于每孔中加入10%的CCK-8试剂，37 ℃避光孵育2 h后，吸取100 μL培养基，570 nm下测A。
1.4 碱性磷酸酶染色 将细胞按2×104个/孔接种于48孔板中，24 h后换含1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol·L-1异槲皮苷培养基，用成骨诱导剂(含1×10-7 mol·L-1地塞米松，50 mg·L-1坏血酸，10 mmol·L-1的β-甘油磷酸)作为阳性对照(OS)，DMSO为阴性对照。第7天吸取上清液做ALP定量检测，按碱性磷酸酶定量试剂盒说明书操作，室温避光孵育1 h后在405 nm处测A。同时将吸去培养基的细胞用PBS清洗3次，然后用70%的乙醇固定30 min，BCIP/NBT染色10 min后加入ddH2O终止反应，再加入ddH2O清洗至溶液无色，晾干后拍照。
1.5 RT-PCR检测 以1×105 个细胞/孔接种于6孔板中。培养24 h后换含1×10-5，1×10-6，1×10-7 mol·L-1异槲皮苷培养基。于第3天收集各组细胞，加入1 mL Trizol试剂裂解细胞，提取总RNA，利用反转录试剂盒将1 μg RNA反转为cDNA，使用实时荧光定量PCR试剂盒和7500 Real Time PCR 仪进行RT-PCR反应，检测ALP，ColI，Runx2及Osterix的基因表达水平。各基因引物序列见表1。通过2-ΔΔCt计算各基因相对表达量。进行3次独立重复实验。, 百拇医药(段爱竹 邓旭亮 李蓉涛)