吴茱萸致小鼠肝毒性分子机制研究(1)
[摘要] 目的：研究吴茱萸提取物致小鼠肝毒性的分子机制。方法：30只KM小鼠随机分为3组，连续灌胃给予吴茱萸提取物15 d后，Western blot法检测小鼠肝脏 Erk1/2，CDK8，CK1e，Stat3，Src蛋白表达量。结果：吴茱萸提取物导致Erk1/2，CDK8，CK1e表达量上调(P<0.01)，Stat3，Src表达量下调(P<0.01)。结论：吴茱萸致肝毒性分子机制可能与Erk1/2，CDK8，CK1e，Stat3和Src信号分子相关。
[关键词] 吴茱萸;肝毒性;分子机制;Western blot
[收稿日期] 2014-05-24
[基金项目] 国家重点基础研究发展计划(973)项目(2009CB522801);国家自然科学基金面上项目(81073047);四川省科技厅基本科研业务专项(A-2011N-22)
, http://www.100md.com
[通信作者] 赵军宁，研究员，博士生导师，Tel：(028) 85226120，E-mail：zarmy@189.cn
[作者简介] 廖文强，博士，副研究员，E-mail：gpcr@163.com
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss) Benth，石虎E. rutaecarpa(Juss) Benth var. officinalis (Dode) Huang或疏毛吴茱萸E. rutaecarpa (Juss) Benth. var. bodinieri (Dode) Huang的干燥近成熟果实。始载于《神农本草经》，列为中品。为温中散寒、疏肝止痛的常用药，用于厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹涨痛、呕吐吞酸、五更泄泻、高血压、外治口疮等[1]。历代文献和现行《中国药典》均记载其“小毒”或“有毒”。前期研究发现吴茱萸可导致肝毒性[2-7]，但其肝毒性的分子机制目前尚不十分清楚，本研究进一步探讨吴茱萸的肝毒性机制，以期为临床安全合理应用提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料
1.1 动物 KM小鼠30只，体重18～22 g，SPF级，雌雄各半，由四川省中医药科学院实验动物中心提供，许可证号SCXK(川)2008-19。
1.2 药物 吴茱萸E. rutaecarpa由四川省中医药科学院资源与种植研究所舒光明研究员重庆红庙村实地采集并鉴定。吴茱萸水提取物：取吴茱萸药材，加水煎煮2次，每次加水10倍，第1次煎煮2 h，第2次煎煮1.5 h，合并煎液，滤过、浓缩，即得。每克药膏含2.47 g原生药，-20 ℃冰箱保存。吴茱萸乙醇提取物：取吴茱萸药材，第1次加入10倍量70%乙醇，回流90 min，第2次加8倍量70%乙醇，回流60 min，过滤、浓缩即得浓稠药膏，每克药膏含原生药3.05 g，-20 ℃冰箱保存。
1.3 仪器 电子天平(德国Sartorius公司);移液枪(法国Eppendorf公司);微量加样吸头(北京中衫金桥生物有限公司);-80 ℃低温冰箱(青岛海尔);4 ℃低温冰箱(青岛海尔);制冰机(美国AF10 SCOTSMAN);去离子水仪(美国PALL， Purelab Plus);PVDF膜(美国Millipore公司);医用X射线胶片(美国柯达公司);通用显影粉、酸性定影粉(天津天陆海感光材料厂);高速离心机(德国Eppendorf公司);转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造公司);电泳仪(北京六一仪器厂);低温离心机(德国Eppendorf);凝胶玻璃板、固定夹(北京六一仪器厂);垂直电泳槽(北京六一仪器厂);转移槽(北京六一仪器厂);7020型全自动生化测试仪(日本日立公司);XYTX-2000新药图像彩色定量分析系统。
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1.4 试剂 AST(天门冬氨酸氨基转移酶，批号0111011)，ALT(丙氨酸氨基转移酶，批号0211021)，TC(总胆固醇，批号0211011)，TG(甘油三脂，批号0311021)均由四川省迈克科技有限责任公司提供。
2 方法
2.1 动物分组与给药剂量 实验分为吴茱萸水提物组、吴茱萸醇提物组、空白对照组，每组10只，雌雄各半，给药组每天灌胃给予小鼠(0.01 mL·g-1体重，相当于原生药16.67 g·kg-1体重)，空白对照组给予等量蒸馏水。
2.2 组织样本收集 小鼠连续灌胃给予吴茱萸15 d后，空白组给予等量蒸馏水。禁食16 h，眼眶采血处死动物。迅速解剖，取下肝脏，立即分装冻存于-20 ℃冰箱。
2.3 总蛋白的提取与测定 取约100 mg组织放入到1 mL裂解液(pH 8.0，含50 mmol·L-1 Tris base，150 mmol·L-1NaCl，0.1%S，10 μL 100 mg·L-1PMSF)中，匀浆器充分研磨。研磨完毕在4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液备用。蛋白含量采用Nano Drop法测定[8]。
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2.4 统计学分析 数据以±s表示，使用SPSS 13.0软件进行统计处理，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为有统计学意义。
3 结果
3.1 吴茱萸对小鼠肝脏指数的影响 解剖肉眼观察主要脏器，对照组小鼠无明显异常;给予吴茱萸提取物15 d后，给药组小鼠肝脏指数较对照组显著增加(P<0.05)，见表1。
3.2 吴茱萸对小鼠血液生化学影响 药后15 d吴茱萸给药组ALT升高，吴茱萸醇提物组与对照比较有显著性差异(P<0.01);吴茱萸醇提物组TG较正常对照组升高(P<0.05)，见表2。, http://www.100md.com(廖文强 李波 李莉 赵军宁)
[关键词] 吴茱萸;肝毒性;分子机制;Western blot
[收稿日期] 2014-05-24
[基金项目] 国家重点基础研究发展计划(973)项目(2009CB522801);国家自然科学基金面上项目(81073047);四川省科技厅基本科研业务专项(A-2011N-22)
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[通信作者] 赵军宁，研究员，博士生导师，Tel：(028) 85226120，E-mail：zarmy@189.cn
[作者简介] 廖文强，博士，副研究员，E-mail：gpcr@163.com
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss) Benth，石虎E. rutaecarpa(Juss) Benth var. officinalis (Dode) Huang或疏毛吴茱萸E. rutaecarpa (Juss) Benth. var. bodinieri (Dode) Huang的干燥近成熟果实。始载于《神农本草经》，列为中品。为温中散寒、疏肝止痛的常用药，用于厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹涨痛、呕吐吞酸、五更泄泻、高血压、外治口疮等[1]。历代文献和现行《中国药典》均记载其“小毒”或“有毒”。前期研究发现吴茱萸可导致肝毒性[2-7]，但其肝毒性的分子机制目前尚不十分清楚，本研究进一步探讨吴茱萸的肝毒性机制，以期为临床安全合理应用提供实验依据。
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1 材料
1.1 动物 KM小鼠30只，体重18～22 g，SPF级，雌雄各半，由四川省中医药科学院实验动物中心提供，许可证号SCXK(川)2008-19。
1.2 药物 吴茱萸E. rutaecarpa由四川省中医药科学院资源与种植研究所舒光明研究员重庆红庙村实地采集并鉴定。吴茱萸水提取物：取吴茱萸药材，加水煎煮2次，每次加水10倍，第1次煎煮2 h，第2次煎煮1.5 h，合并煎液，滤过、浓缩，即得。每克药膏含2.47 g原生药，-20 ℃冰箱保存。吴茱萸乙醇提取物：取吴茱萸药材，第1次加入10倍量70%乙醇，回流90 min，第2次加8倍量70%乙醇，回流60 min，过滤、浓缩即得浓稠药膏，每克药膏含原生药3.05 g，-20 ℃冰箱保存。
1.3 仪器 电子天平(德国Sartorius公司);移液枪(法国Eppendorf公司);微量加样吸头(北京中衫金桥生物有限公司);-80 ℃低温冰箱(青岛海尔);4 ℃低温冰箱(青岛海尔);制冰机(美国AF10 SCOTSMAN);去离子水仪(美国PALL， Purelab Plus);PVDF膜(美国Millipore公司);医用X射线胶片(美国柯达公司);通用显影粉、酸性定影粉(天津天陆海感光材料厂);高速离心机(德国Eppendorf公司);转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造公司);电泳仪(北京六一仪器厂);低温离心机(德国Eppendorf);凝胶玻璃板、固定夹(北京六一仪器厂);垂直电泳槽(北京六一仪器厂);转移槽(北京六一仪器厂);7020型全自动生化测试仪(日本日立公司);XYTX-2000新药图像彩色定量分析系统。
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1.4 试剂 AST(天门冬氨酸氨基转移酶，批号0111011)，ALT(丙氨酸氨基转移酶，批号0211021)，TC(总胆固醇，批号0211011)，TG(甘油三脂，批号0311021)均由四川省迈克科技有限责任公司提供。
2 方法
2.1 动物分组与给药剂量 实验分为吴茱萸水提物组、吴茱萸醇提物组、空白对照组，每组10只，雌雄各半，给药组每天灌胃给予小鼠(0.01 mL·g-1体重，相当于原生药16.67 g·kg-1体重)，空白对照组给予等量蒸馏水。
2.2 组织样本收集 小鼠连续灌胃给予吴茱萸15 d后，空白组给予等量蒸馏水。禁食16 h，眼眶采血处死动物。迅速解剖，取下肝脏，立即分装冻存于-20 ℃冰箱。
2.3 总蛋白的提取与测定 取约100 mg组织放入到1 mL裂解液(pH 8.0，含50 mmol·L-1 Tris base，150 mmol·L-1NaCl，0.1%S，10 μL 100 mg·L-1PMSF)中，匀浆器充分研磨。研磨完毕在4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液备用。蛋白含量采用Nano Drop法测定[8]。
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2.4 统计学分析 数据以±s表示，使用SPSS 13.0软件进行统计处理，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为有统计学意义。
3 结果
3.1 吴茱萸对小鼠肝脏指数的影响 解剖肉眼观察主要脏器，对照组小鼠无明显异常;给予吴茱萸提取物15 d后，给药组小鼠肝脏指数较对照组显著增加(P<0.05)，见表1。
3.2 吴茱萸对小鼠血液生化学影响 药后15 d吴茱萸给药组ALT升高，吴茱萸醇提物组与对照比较有显著性差异(P<0.01);吴茱萸醇提物组TG较正常对照组升高(P<0.05)，见表2。, http://www.100md.com(廖文强 李波 李莉 赵军宁)