硒化壳聚糖促创面愈合作用的体内研究(2)
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Key words: selenium chitosan cream; superficial second degree burn; hydroxyproline; TNF-α; NO
硒化壳聚糖[1]是将壳聚糖与亚硒酸在酸性条件下，以混合金属离子为催化剂，通过拼合原理制备而成的有机硒，前期研究结果显示，硒化壳聚糖可显著促进体外培养的人皮肤成纤维细胞和表皮细胞增殖，且无明显毒副作用[2-3]，这为进一步将硒化壳聚糖开发成促创伤愈合药奠定了基础。硒化壳聚糖软膏是以硒化壳聚糖为主制备而成的软膏剂[4]，为评价其体内作用效果，笔者在小鼠身上复制浅Ⅱ度烫伤模型，观察了硒化壳聚糖软膏用于治疗烫伤的疗效并探讨了可能的作用机制。
1 材料和方法
1.1 药品试剂与仪器：谷丙转氨酶(ALT)、L-羟脯氨酸试剂盒、一氧化氮(NO)、血肌酐(Crea)、肿瘤坏死因子(TNF)试剂盒(南京建成生物工程公司)；京万红软膏(天津达仁堂制药二厂，批号211556)；UV-Vis 9200分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)；HH-2型数显恒温水浴锅(国华电器公司)；Medal680酶标仪(美国Bio-Rad公司)；昆明种3月龄小鼠，我院实验动物中心提供，许可证号SCXK(鄂)2006-2009。
1.2方法
1.2.1硒化壳聚糖软膏制备：参见文献[4]。
1.2.2动物模型制作[5]：参照文献[5]方法将小鼠背部用8%的Na2S水溶液脱毛，脱毛后适应1天，禁食，乙醚麻醉，脱毛区放入70℃恒温水浴中6s，制备10%浅Ⅱ度烫伤模型。造模成功以肉眼可见创缘环绕一白色边界线，与创面周围正常皮肤形成明显的分界，病理切片见真皮乳头层有明显充血、水肿和白细胞浸润，胶原纤维肿胀、离散。将烫伤小鼠随机分为3组，即硒化壳聚糖软膏组(A)、不含硒化壳聚糖固体分散剂和冰片的空白基质组(B)、京万红组(C)，每组49只，另取7只小鼠不烫伤，作为正常对照组。
1.2.3给药方法：各组小鼠分别外用硒化壳聚糖软膏纱布(1ml/cm2)、基质纱布(1ml/cm2)、京万红纱布(1ml/cm2)覆盖，包扎固定后分笼饲养，每日换药一次。
1.2.4检测指标：在伤后12h，第1、3、5、7和9天，分别处死各组小鼠7只，取标本检测创面含水量、创面羟脯氨酸含量、创面组织TNF-α水平、NO含量和ALT活性，每组中所剩7只用于观测创面愈合时间，即创面瘢痕完全脱落所需时间。创面含水量测定[6]：处死小鼠后，取创面组织约1g，称重，放入80℃烤箱中，烘烤72h后称重，组织含水量＝(湿重-干重)/湿重×100%。羟脯氨酸含量测定参见文献[7]方法。TNF-α、NO、ALT按试剂盒说明检测。
1.2.5统计学处理：所获数据均以x±s表示，应用SPSS 13.0统计软件进行方差分析，组间、组内比较采用ANOVA分析。
2 结果
2.1 创面愈合时间 A组小鼠创面愈合平均时间为(12.9±2.9)天，与B组平均时间16.3±2.1天明显减少，有统计学意义(P<0.05),与C组11.8±2.4天比较无差异(P>0.05)。
2.2 创面组织含水量 各组小鼠烫伤后创面组织含水量均较空白对照组显著增高，伤后12h达到高峰，其后开始下降。伤后第1、3、5天A组的小鼠创面含水量显著低于B组(P<0.05)，与C组比较无显著差别(P>0.05)，第7天以后各组小鼠创面含水量则没有显著差异,见表1。
2.3创面组织TNF-α水平各组烫伤后小鼠创面组织TNF-α水平均高于烫伤前的正常水平(P<0.05)，伤后12h至1天达高峰，随后逐渐下降，至伤后第5天仍高于烫伤前正常对照组(P<0.05)，伤后第7天各组TNF水平基本恢复至正常。烫伤后12h、1天、3天、5天，A组和C组与B组比较，创面组织中TNF水平减少(P<0.05)；A组和C组比较，差异无统计学意义,见表2。
2.4 NO含量 各烫伤组小鼠创面组织NO含量均高于烫伤前正常对照组(P<0.05,P<0.01)，伤后12h达高峰，随后下降，至伤后第9天仍高于正常对照组(P<0.05)。伤后12h、1天，B组创面组织NO含量明显高于A组和C组(P<0.05)，A组和C组创面组织NO含量各时相点比较均无显著差异(P>0.05)，见表3。
2.5创面羟脯氨酸含量烫伤后小鼠创面羟脯氨酸含量进行性增加，但从烫伤后第3天起，A组小鼠羟脯氨酸含量增加速度明显加快，各对应时相点羟脯氨酸含量均显著高于B组和C组(P<0.05),见表4。
2.6谷丙转氨酶水平 各组小鼠各时相点血中ALT活性与烫伤前相比较无显著性差异(P>0.05)，伤后各时相点A组ALT水平与B组和C组比较亦无显著性差异(P>0.05),见表5。
3 讨论
烧烫伤是临床常见损伤，小面积烧烫伤主要采用药物涂敷暴露或半暴露治疗，由于临床所用的促创面愈合外用药多为膏剂，故将硒化壳聚糖加工成膏剂来评估其药效较为合适。本研究以京万红为阳性对照，以制作硒化壳聚糖软膏所用的基质为对照，观察硒化壳聚糖软膏对浅Ⅱ度烫伤小鼠创面愈合的影响，结果发现，在外用硒化壳聚糖软膏后，烫伤小鼠创面愈合平均时间比基质组明显缩短，创面水肿消退时间也快于基质组，说明硒化壳聚糖软膏确实具有促创面愈合的作用。
已知炎症反应全程参与了创面的损伤和修复，烧伤后创面组织细胞和炎症细胞大量释放炎症因子引发局部炎症反应，并同时启动创面修复，使细胞进入增殖修复状态， TNF是参与炎症反应的主要炎症因子之一[8]。本研究表明，烫伤后小鼠创面组织TNF显著增加，但硒化壳聚糖软膏组在各时相点尤其是在烫伤后3天内，均能显著减少TNF的释放，表明硒化壳聚糖软膏可有效抑制创面组织中TNF等炎症因子的过度合成和释放，降低炎症反应强度，减轻过度炎症反应对创面的损伤。
组织损伤可诱导产生大量NO，高浓度NO作为一种前炎性细胞因子，能和超氧阴离子等反应，引发体内自由基的链式反应，还能促进炎症局部多种细胞因子合成，从而引发瀑布式的炎性反应，直接和间接损伤组织细胞[9]。本研究显示，烫伤可使小鼠创面组织NO含量显著增加并持续较长时间，而硒化壳聚糖软膏则能显著减少NO含量，从而从源头上减轻或抑制了炎性反应的发生。
胶原合成是创面愈合过程的重要环节，由于羟脯氨酸所占胶原的比例相对恒定，故测定羟脯氨酸的含量便可反映胶原的水平。本实验中各组小鼠创面羟脯氨酸的含量随着时间的延长均有增加，但第三天开始硒化壳聚糖软膏组羟脯氨酸的含量就显著高于基质组和京万红组，说明硒化壳聚糖软膏有促进创面胶原合成的作用。
以上研究表明硒化壳聚糖软膏在烫伤后早期能通过减少创面组织TNF和NO的合成和释放，减轻炎性反应，阻止创面进一步加深和坏死对创面产生保护，后期则通过增强胶原合成来促进创面愈合，而对谷丙转氨酶活性的检测结果显示硒化壳聚糖软膏未对小鼠的肝功能产生明显损伤，说明硒化壳聚糖软膏确实是一种值得开发的治疗烫伤外用药。
[参考文献]
[1]孙兰萍,张胜义,许晖 ......
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