胃癌耐药研究中二维电泳凝胶显色方法的分析(1)
【摘要】 目的 分析利用蛋白质组学方法研究胃癌耐药相关蛋白质中双向电泳凝胶的染色显示。方法 培养胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的耐药胃癌细胞SGC7901/VCR，用双向凝胶电泳技术分离总蛋白，银染及胶体考马斯亮蓝染色，Image Scanner扫描仪扫描凝胶。结果 获得了背景清晰、重复性好的双向凝胶电泳图谱，两种染色凝胶相比，硝酸银染色在样品少时显示更佳，过量则影响图像质量，而胶体考马斯亮蓝染色在上样量增加时的凝胶蛋白质点数目及丰度均增加，并无明显拖尾。结论 两种显色方法受样品量影响较大，恰当选用有利于通过蛋白质组学研究胃癌耐药机制工作的进一步开展。
【关键词】长春新碱；胃癌；多药耐药；二维凝胶电泳；凝胶显色
Analysis for staining methods of two-dimentional patterns in drug resistant gastric carcinoma cells research
, http://www.100md.com
WANG Yu-jie,SU Tong-fu,YANG Yi-xuan.Department of Gastroenterology,Fifth People’s Hospital of Zhengzhou 450002,China
【Abstract】 Objective To investigate staining methods for two-dimensional gel(2-DE)electrophoresis in multidrug resistance of gastric cancer.Methods Cultured vincristine-resistant human gastric cancer cell line SGC7901/VCR and its parental cell line SGC7901.Variant amount protein of those cells were separated by 2-DE.Gels were stained with silver nitrate or colloidal Coomassie brilliant blue,and scanned by Image Scanner.Results Well-resolved,reproducible 2-DE patterns of SGC7901/VCR and SGC7901 were established.Silver staining was better when protein sample amount was low，overloaded protein will interfere resolution of the maps.Gels stained with colloidal Coomassie brilliant blue had more protein spots numbers and abundance without apparent trails when increased loading protein sample.Conclusion Two staining methods were influenced largely by the sum of protein samples，properly selection may be helpful for further study with proteomics in multidrug resistance of gastric cancer.
, http://www.100md.com
【Key words】Vincristine；Gastric cancer；Multidrug resistance；Two-dimensional gel electrophoresis；Staining
胃癌是常见的消化道肿瘤，确诊时多属中晚期，单纯手术效果较差，多需结合化疗，尽管目前已有多种化疗药物可供临床选择，而多药耐药仍是影响胃癌治疗的重要因素。有关耐药的具体机制尚不完全清楚，蛋白质组学是目前此方面研究的重要手段，双向凝胶电泳则是此新兴学科的支柱技术之一。为进一步明确胃癌多药耐药机制，我们分析了获得胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的耐药胃癌细胞SGC7901/VCR的双向凝胶电泳图谱的不同显色方法，为下一步研究工作的开展奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、超纯尿素、CHAPS购自Promega。2-DE蛋白定量试剂盒(2-D Quant Kit)、IPG缓冲液pH3-10及24 cm固相化pH梯度干胶条pH3~10、覆盖液均购自Amershan Pharmacia公司。二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺购自Sigma公司。考马斯亮蓝G-250购自USB公司，硝酸银、甲醛、戊二醛、硫代硫酸钠、碳酸钠和氯化钙均为国产分析纯。
, http://www.100md.com
1.1.2 仪器 IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT垂直电泳槽、Image Scanner扫描仪系Amersham Biosciences公司产品。全自动酶标仪购自美国BIO-TEK公司，水平摇床购自北京沃德生物医学仪器公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的多药耐药胃癌细胞SGC7901/VCR系第四军医大学西京医院樊代明教授惠赠。SGC7901/VCR用含1.0 mg/L长春新碱的培养液培养以维持其耐药表型。
1.2.2 细胞总蛋白抽提 收集对数生长期的SGC7901和SGC7901/VCR细胞，加入细胞裂解液(8 mol/L尿素，4%CHAPS,40 mmol/L Tris,65 mmol/L DTT)4℃裂解2 h，12 000 r/min，4℃离心45 min后取上清即为细胞总蛋白质，用蛋白定量试剂盒(Amersham Biosciences)测定蛋白浓度,-80℃冻存备用，后室温裂解2 h，然后4℃12 000 g离心50 min，吸上清后分装并按说明用2-DE蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。5 μl胃癌SGC7901与SGC7901/VCR细胞蛋白质样品及倍比稀释的 2 mg/ml小牛血清标准品均取三管进行测定，用酶标仪在490 nm处读取OD值，取平均值作标准曲线并计算蛋白质浓度以减少实验误差。
, http://www.100md.com
1.2.3 双向凝胶电泳 配制平衡液储液(50 mmol/L Tris-Hcl pH 8.8、6 mmol尿素、30%甘油及痕量溴酚蓝)。取250、500 μg及1 mg蛋白质样品分别与水化液(8 mol/L Urea、4%CHAPS、40 mmol/L Tris、18 mmol/LDTT、0.5%IPG缓冲液pH3~10及痕量溴酚蓝)混合后上样，上样总体积为450 μl。然后进行固相pH梯度3~10等电聚焦电泳，具体参数设置为30V水化14 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、8 000 V 10 h。等电聚焦结束后将一橡胶条分别置于10 ml平衡A液(含0.2%DTT的平衡液储液)和10 ml平衡B液(含3%碘乙酰胺的平衡液储液)中水平摇床上各平衡15 min，然后转移胶条至12%的0.75 mm SDS-PAGE胶上端进行第二向垂直电泳。
, 百拇医药(王郁杰 苏同福 杨轶轩)
【关键词】长春新碱；胃癌；多药耐药；二维凝胶电泳；凝胶显色
Analysis for staining methods of two-dimentional patterns in drug resistant gastric carcinoma cells research
, http://www.100md.com
WANG Yu-jie,SU Tong-fu,YANG Yi-xuan.Department of Gastroenterology,Fifth People’s Hospital of Zhengzhou 450002,China
【Abstract】 Objective To investigate staining methods for two-dimensional gel(2-DE)electrophoresis in multidrug resistance of gastric cancer.Methods Cultured vincristine-resistant human gastric cancer cell line SGC7901/VCR and its parental cell line SGC7901.Variant amount protein of those cells were separated by 2-DE.Gels were stained with silver nitrate or colloidal Coomassie brilliant blue,and scanned by Image Scanner.Results Well-resolved,reproducible 2-DE patterns of SGC7901/VCR and SGC7901 were established.Silver staining was better when protein sample amount was low，overloaded protein will interfere resolution of the maps.Gels stained with colloidal Coomassie brilliant blue had more protein spots numbers and abundance without apparent trails when increased loading protein sample.Conclusion Two staining methods were influenced largely by the sum of protein samples，properly selection may be helpful for further study with proteomics in multidrug resistance of gastric cancer.
, http://www.100md.com
【Key words】Vincristine；Gastric cancer；Multidrug resistance；Two-dimensional gel electrophoresis；Staining
胃癌是常见的消化道肿瘤，确诊时多属中晚期，单纯手术效果较差，多需结合化疗，尽管目前已有多种化疗药物可供临床选择，而多药耐药仍是影响胃癌治疗的重要因素。有关耐药的具体机制尚不完全清楚，蛋白质组学是目前此方面研究的重要手段，双向凝胶电泳则是此新兴学科的支柱技术之一。为进一步明确胃癌多药耐药机制，我们分析了获得胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的耐药胃癌细胞SGC7901/VCR的双向凝胶电泳图谱的不同显色方法，为下一步研究工作的开展奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、超纯尿素、CHAPS购自Promega。2-DE蛋白定量试剂盒(2-D Quant Kit)、IPG缓冲液pH3-10及24 cm固相化pH梯度干胶条pH3~10、覆盖液均购自Amershan Pharmacia公司。二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺购自Sigma公司。考马斯亮蓝G-250购自USB公司，硝酸银、甲醛、戊二醛、硫代硫酸钠、碳酸钠和氯化钙均为国产分析纯。
, http://www.100md.com
1.1.2 仪器 IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT垂直电泳槽、Image Scanner扫描仪系Amersham Biosciences公司产品。全自动酶标仪购自美国BIO-TEK公司，水平摇床购自北京沃德生物医学仪器公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的多药耐药胃癌细胞SGC7901/VCR系第四军医大学西京医院樊代明教授惠赠。SGC7901/VCR用含1.0 mg/L长春新碱的培养液培养以维持其耐药表型。
1.2.2 细胞总蛋白抽提 收集对数生长期的SGC7901和SGC7901/VCR细胞，加入细胞裂解液(8 mol/L尿素，4%CHAPS,40 mmol/L Tris,65 mmol/L DTT)4℃裂解2 h，12 000 r/min，4℃离心45 min后取上清即为细胞总蛋白质，用蛋白定量试剂盒(Amersham Biosciences)测定蛋白浓度,-80℃冻存备用，后室温裂解2 h，然后4℃12 000 g离心50 min，吸上清后分装并按说明用2-DE蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。5 μl胃癌SGC7901与SGC7901/VCR细胞蛋白质样品及倍比稀释的 2 mg/ml小牛血清标准品均取三管进行测定，用酶标仪在490 nm处读取OD值，取平均值作标准曲线并计算蛋白质浓度以减少实验误差。
, http://www.100md.com
1.2.3 双向凝胶电泳 配制平衡液储液(50 mmol/L Tris-Hcl pH 8.8、6 mmol尿素、30%甘油及痕量溴酚蓝)。取250、500 μg及1 mg蛋白质样品分别与水化液(8 mol/L Urea、4%CHAPS、40 mmol/L Tris、18 mmol/LDTT、0.5%IPG缓冲液pH3~10及痕量溴酚蓝)混合后上样，上样总体积为450 μl。然后进行固相pH梯度3~10等电聚焦电泳，具体参数设置为30V水化14 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、8 000 V 10 h。等电聚焦结束后将一橡胶条分别置于10 ml平衡A液(含0.2%DTT的平衡液储液)和10 ml平衡B液(含3%碘乙酰胺的平衡液储液)中水平摇床上各平衡15 min，然后转移胶条至12%的0.75 mm SDS-PAGE胶上端进行第二向垂直电泳。
, 百拇医药(王郁杰 苏同福 杨轶轩)