颗粒酶在心脏移植急性排斥反应中的作用
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【关键词】 颗粒酶;心脏移植;急性排斥反应
心脏移植是治疗终末期心脏病的有效方法,虽然已有多种免疫抑制剂广泛应用于临床,但心脏移植的术后并发症主要仍是排斥反应,其中最常见的是急性排斥反应。治疗的关键在于如何早期确定急性排斥反应的严重程度以确定是否需用免疫抑制药物,在移植物造成细胞性损伤前逆转排斥反应[1]。同种异体移植的急性免疫排斥反应是由多种调节因子,效应细胞间复杂相互作用的结果。细胞免疫应答在急性排斥反应中发挥主要作用,其中CD8+T细胞是重要的效应细胞。CD8+T细胞主要通过穿孔素、颗粒酶途径杀伤靶细胞[2]。
具有杀伤作用的CTL细胞经抗原激发,活化成为效应细胞,活化的CTL可通过颗粒-胞吐途径介导的溶细胞作用杀伤靶细胞。活化的CTL胞浆的颗粒中含有穿孔素和颗粒酶。CTL与靶细胞通过T细胞受体(TCR)特异识别并连接,CTL胞浆中的颗粒定向移位于接触部位,通过细胞排粒,颗粒中的穿孔素和颗粒酶释放到细胞间隙,穿孔素以单体形式插入靶细胞膜,形成“孔道”,促使颗粒酶进入靶细胞,引起靶细胞DNA断裂,导致靶细胞凋亡。活化的CTL与靶细胞的接触由Mg2+依赖,一旦靶细胞凋亡结束,CTL就在缺乏Mg2+的状态与靶细胞脱离,参加再循环;再循环CTL可对靶细胞重复杀伤5~7次,此后失去杀伤活性当靶细胞数多于CTL时,CTL的再循环发挥关键作用[3]。
颗粒酶分子颗粒酶是一组同源性的丝氨酸蛋白酶,人颗粒酶包括GzmA、 B、 K、H等成员,与PFN一起存在于活化的CTL和NK细胞胞浆颗粒中,是CTL和NK细胞发挥细胞毒的主要效应分子。人GzmA基因定位于5号染色体上。GzmA分子为由两个单体通过二硫化合物连接成相对分子质量为60 000的同源二聚体,具有类胰蛋白酶的性质,在体内能缓慢引起靶细胞DNA断裂。人GzmB基因定位于14号染色体上,酶相对分子质量有30000,32 000, 35 000 3种,经葡萄糖昔酶水解后均剩下1个相对分子质量为27 000的蛋白核心,说明3种形式的GzmB是同一蛋白带有不同的糖基[4]。GzmB具有天门冬氨酸酶的活性,是主要效应分子,能迅速引起靶DNA断裂,作用强于GzmA,其纯化的单克隆抗体已广泛地应用于研究中。Gzms之间高度同源,其包含胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶的催化性三联体His-57, Asp-102, Ser-195。其他特征包括:N端Ile-Ile-Gly-Gly序列;含有3-4个二硫键;含有一个同样出现于中性粒细胞组织蛋白酶(cathepsin) G5、肥大细胞食糜酶(chymase)的保守基序(PHSRPYMA)。
颗粒酶与穿孔素协同发挥作用。穿孔素和颗粒酶B对双标记靶细胞(51Cr标记靶细胞胞浆蛋白质,125I-Udr标记靶细胞DNA)的作用实验表明,单用穿孔素引起51Cr释放但无125I释放;单用颗粒酶B不能引起任何释放;只有穿孔素和颗粒酶B同时存在时,才能测到51Cr和125I同时迅速释放。这一试验证实了穿孔素引起靶细胞膜受损,颗粒酶B随后引起靶DNA断裂。GzmB在穿孔素存在时,在靶细胞浆内再分布,集中于细胞核时,才导致细胞凋亡。在无穿孔素存在的情况下, 颗粒酶B能够通过能量依赖途径穿过细胞膜,进入细胞浆内,但细胞并无明显的损害。这是因为PFP可引发凋亡和影响颗粒酶B向细胞核内转移。
颗粒酶B进入细胞后通路何种信号转导通路诱导细胞凋亡尚还不完全清楚。现有的资料显示,GzmB可以在细胞质、线粒体和细胞核三个层次作用于不同的分子诱导细胞凋亡。研究显示:GzmB可能经由Caspases途径杀伤细胞:Caspases是一组半肤天冬蛋白酶,细胞凋亡信号可引起Caspase激活。无活性酶原(pro -caspases)内部两个保守性Asp残基被特异酶切后形成双链,以类似酶原激活方式呈级联放大效应,导致细胞凋亡。试验表明,GzmB能切割作为DNA损伤修复传感分子的PARP,产生1个相对分子质量为54 000或41 000的片段,而caspase-3的切割产物是1个89 000的片段。GzmB在体外和体内试验中均能迅速切割DNA-PKcs和NuMA,但所得产物片段与caspase-3切割所得有所不同。将PFN与GzmA / GzmB共同在37℃作用于K562细胞,用抗lamin B的单抗作探针,见GzmA对lamin B的切割不被caspase的抑制剂所阻断。提示Gzms对lamin可以直接切割,而不依赖caspase途径。GzmB对caspase-7和caspase-10的切割是所有已知Gzms中最有效的,30 min内90%的caspase-7和caspase-10即被有效切割。这一过程可由PFN / GzmB或由Fas / FasL介导。故有理论认为:GzmB可能并不直接切割产生有活性的成熟caspases,也不直接加速caspases级联放大过程,但一旦caspase途径中某个caspase位口(caspase-3或caspase-10)缺失或是切割受抑制,GzmB将切割后续pro-caspase, GzmB在完整的caspase途径中不起作用[5-6]。近来又同时有两个实验室报道,GzmB可以直接酶解Sid和Bax等,启动细胞色素C的释放,而且这种途径勿需激活caspase[7]。GzmB除在胞浆中激活caspase级联反应启动凋亡外,还可直接迁移至细胞核,切割Nu MA和PARP(体外、体内)、DNA PKcs(体外)等一系列核蛋白,启动或促进核凋亡事件。GzmB对核内物质具亲和力,体外除去核膜的细胞核中可观察到大量GzmB聚积。现又从文献中发现,GzmB能直接作用于部分断裂的基因组DNA,使其发生进一步裂解。总之,GzmB进入细胞后,可能通过多种方式作用于靶细胞,诱导其凋亡。
国外学者应用免疫组化、原位杂交、Northern blot杂交和RT-PCR等技术探讨了颗粒酶B在同种移植免疫排斥中的作用。在人的心脏、肝、肾、肠同种异体移植的急性排斥的移植物活检中,颗粒酶B基因的表达水平均显著高于同基因移植者,在急性排斥反应的早期,即移植后24 h内,其基因mRNA表达水平已明显升高,并急剧增加至高峰(<5~6 d),尔后仍处于较高水平的表达,并贯穿急性排斥反应的全过程,且与排斥反应的严重程度相平行,如表达阳性,预示将转变为严重的急性排斥反应,需附加免疫抑制治疗,如表达阴性,说明移植物处于稳定状态,无需附加免疫抑制剂[8-9]。
颗粒酶参与了介导器官移植的急性排斥反应,尽管其确切机制尚未完全清楚,但随着急性排斥机制研究的进一步深入和其他介导途径的发现,颗粒酶基因表达可能会成为诊断急性排斥反应和判断免疫抑制疗效的早期、可靠的指标,并通过反义技术封闭该基因表达来抑制器官移植的急性排斥反应。
心脏移植是治疗终末期心脏病的有效方法。近十年来,心脏移植患者数量明显增加,成活率明显提高,存活时间延长。但心脏移植的术后并发症主要是急性排斥反应。心脏移植术后第一年是否成功,主要取决于对急性排斥反应的控制情况,而控制急性排斥反应主要在于是否有恰当而确切的急性反应监测指标 ......
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